Isolierung von Amyloid-Fibrillen aus Hirngewebeextrakt

Zusammenfassung

Quelle: Upadhyay, A. et al., Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt das Protokoll zur Isolierung von Amyloidfibrillen aus Maushirngewebeextrakt mittels Dichtegradientenzentrifugation und Verdauung von Nicht-Amyloid-Proteinen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Gewebeentnahme und Amyloid-Reinigung

HINWEIS: Idealerweise sollten Amyloidfibrillen aus frisch präparierten Hirnregionen isoliert werden. Diese Methode funktioniert aber auch gut mit Schnapp- oder schockgefrorenem Hirngewebe. Im Folgenden finden Sie einen kurzen Überblick über das Snap-Freezing von Gehirngewebe zur Aufbewahrung für eine spätere Verwendung.

1. Entnahme und Lagerung von Hirngewebe: Sezieren Sie die Gehirne von Mäusen und ernten Sie schnell die amyloidbeladenen Regionen (d. h. Kortex und Hippocampus), gefolgt von einem schnellen Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder einem Trockeneisalkoholbad.
   Anmerkung: Das Schockgefrieren hilft, die strukturellen Eigenschaften der Bestandteile des Gewebes zu erhalten. Die Mäuse werden durch Isofluran und Zervixluxation euthanasiert. Es wird empfohlen, die Verwendung von CO₂ zu vermeiden, da dies die Integrität des Gehirnproteoms beeinträchtigen kann.
2. Nach dem Präparieren, Schneiden und Aufbewahren von frischem Gewebe in kleinen Blöcken (z. B. 5 mm x 5 mm), da dies eine effizientere Homogenisierung vor der Amyloid-Extraktion ermöglicht. Übertragen Sie das Gewebe in das sterile kryogene Fläschchen, ziehen Sie die Kappe fest und tauchen Sie schnell ein.
3. Bewahren Sie das Gewebe unter ultrakalten Bedingungen (z. B. -80 °C oder flüssiger Stickstoff) ein. Wenn die Extraktion einige Tage später durchgeführt werden soll, lagern Sie das Gewebe bei -20 °C und vermeiden Sie Gefrier- und Auftauzyklen. Tauen Sie das gefrorene Gewebe auf nassem Eis auf, wenn es zur Extraktion und Reinigung bereit ist.
   Anmerkung: Der direkte Kontakt des Gewebes mit flüssigem Stickstoff kann Gewebe- und Proteinschäden verursachen. Beachten Sie, dass ein Alkoholbad Permanentmarker von den Tubenetiketten entfernen kann.

>2. Anreicherung von unlöslichem Natriumdodecylsulfat (SDS)

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis durch und zentrifugieren Sie bei 4 °C, sofern nicht anders angegeben. Hersteller und Katalognummern von Chemikalien und Instrumenten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Beginnen Sie mit frisch präparierten oder schockgefrorenen Hirngeweberegionen (auf Eis aufgetaut), die in ein 2-ml-Röhrchen mit 6-8 Keramikkügelchen und frisch zubereitetem eiskalten Homogenisierungspuffer (1 mL für 0,25-1 g nasse Gewebemasse) gegeben werden.
2. Übergeben Sie die Röhrchen in den Homogenisator der Kugelmühle und mahlen Sie den Gewebeinhalt bei 4000 U/min, mit zwei Zyklen à 30 s und einem Intervall von 30 s dazwischen.
   Anmerkung: Alternativ können motorisierte Rühr- oder Homogenisatorsysteme zum Mahlen und Homogenisieren des Gewebes eingesetzt werden.
3. Geben Sie 9 mL eiskalten Homogenisierungspuffer zu dem 1 mL Homogenat des gesamten Gehirngewebes in 15 ml-Röhrchen, versiegeln Sie es mit Laborwachsfilmstreifen und drehen Sie es über Nacht bei 4 °C von einem Ende zum anderen, um eine robuste Solubilisierung zu gewährleisten.
   Anmerkung: Um unerwünschte große Zelltrümmer und Lipide zu entfernen, drehen Sie die Röhrchen am nächsten Morgen bei 800 x g bei 4 °C für 10 min und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Röhrchen. Das restliche Pellet in 2 mL eiskaltem Homogenisierungspuffer resuspendieren, gut mischen, erneut 10 min bei 4 °C schleudern und die beiden Überstände vermischen.
4. Feste Saccharose langsam bis zu einer Endkonzentration von 1,2 M in die Gewebeextraktsuspension geben, gut mischen und bei 250.000 x g für 45 min bei 4 °C zentrifugieren.
5. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Das Pellet wird in 2 mL Homogenisierungspuffer mit 1,9 M Saccharose durch Zerreibung resuspendiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 125.000 x g für 45 min bei 4 °C.
   Anmerkung: Das Puffervolumen kann basierend auf der Menge des aus dem vorherigen Schritt zurückgewonnenen Materials angepasst werden. Im Allgemeinen sind 10 Volumen Homogenisierungspuffer (V/V) ideal für diesen Schritt.
6. Entnehmen Sie die oberste weiße Feststoffschicht mit einer Pipette, geben Sie sie in ein frisches Röhrchen und lösen Sie sie in 1 ml eiskaltem Waschpuffer auf, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen einzuführen.
7. Neben der Deckschicht ist das Pellet auch mit Amyloidfibrillen angereichert. Für eine höhere Ausbeute kombinieren Sie die beiden Fraktionen und fahren Sie fort. Entfernen Sie vorsichtig die mittlere wässrige Schicht mit einer Pipette und entsorgen Sie sie.
8. Die kombinierten Fraktionen werden bei 8000 x g 20 min lang bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.
9. Geben Sie 1 ml eiskalten Aufschlusspuffer in das gewaschene Pellet, resuspendieren Sie es und inkubieren Sie es 3 h lang bei Raumtemperatur (RT).
Bei
10. 8000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
11. Resuspendieren und waschen Sie das aufgeschlossene Pellet zweimal in 1 mL eiskaltem Tris-Puffer (wie in Schritt 2.8).
12. Das gewaschene Pellet wird in 1 ml Solubilisierungspuffer mit 1 % SDS und 1,3 M Saccharose durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Schnell zentrifugieren bei 200.000 x g für 60 min bei 4 °C.
    Anmerkung: Obwohl die Amyloidfibrillen sehr widerstandsfähig gegen Detergenzien und Vergällungsmittel sind, kann eine sehr lange Exposition gegenüber dem Detergens (1 % SDS) die Integrität der Fibrillen beeinträchtigen oder die fest gebundenen Proteine entfernen, was nachfolgende Analysen beeinträchtigt. Fahren Sie daher unmittelbar nach dem Resuspendieren der Pellets mit der Zentrifugation fort.
13. Bewahren Sie das Pellet auf und vergrößern Sie das Volumen des verbleibenden Überstands durch Zugabe von 50 mM Tris-Puffer (im Verhältnis 1:0,3), um die Saccharosekonzentration von 1,3 auf 1 M zu reduzieren, und zentrifugieren Sie ein weiteres Mal bei 200.000 x g für 45 min bei 4 °C.
14. Die beiden Pellets werden in 100 μl Tris-Puffer mit 0,5 % SDS aufgelöst und zur Amyloid-Aufreinigung aufgefüllt. Sichtbare Pellets sind klein und sollten undurchsichtig und cremefarben erscheinen (siehe Abbildung 1A).

Ergebnisse

Abbildung 1: Bestätigung der Amyloid-Extraktion durch biochemische Färbung und Bildgebung von Amyloidfibrillen. (A) Angereichertes amyloidhaltiges unlösliches SDS-Pellet erscheint undurchsichtig, cremefarben. (B) Kongorotfärbung von löslichem SDS-Überstand und unlöslichem SDS-Pellet, das gereinigtes Amyloid enthält, das auf einer 0,45 μm Nitrocellulosemembran getu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Protease Inhibito	Thermo Scientific	164535	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. C1016	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
Kollagenase	Sigma-Aldrich	Nr. C0130	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
Kompletter Proteasehemmer-Cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	EN0521	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
K54 Motor für Gewebe-Homogenisierungssystem	Cole Parmer	Glas-Col 099C	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
Optima L-90K Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	BR-8101P-E	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
Precellys 24 Gewebe-Homogenisator	Bertin Instrumente	P000062-PEVO0-A	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 74255	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
Sorvall Legend Micro 21R Mikrozentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002446	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025	Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden