Bewertung der Reaktion von Interneuronen auf chemoattraktive Signale von periventrikulären Endothelzellen

Zusammenfassung

Quelle: Datta, D., et al. Migrations-, Chemo-Anziehungs- und Co-Kultur-Assays für aus menschlichen Stammzellen gewonnene Endothelzellen und GABAerge Neuronen. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt eine Methode, um die Migration von Interneuronen als Reaktion auf chemoattraktive Signale von periventrikulären Endothelzellen (PVECs) zu testen. Die Interneurone befinden sich in einem zentralen Kompartiment, mit PVECs und Kontrollzellen auf beiden Seiten. Eine erhöhte Migration in Richtung PVECs deutet auf eine positive Reaktion auf ihre chemoattraktiven Signale hin.

Protokoll

>1. Chemo-Anziehungs-Assay

1. Platzieren Sie mit einer sterilen Pinzette einen Drei-Well-Kultureinsatz in der Mitte einer mit Poly-L-Ornithin/Laminin beschichteten 35-mm-Schale.
2. Drehen Sie die Schüssel auf den Kopf. Markieren Sie die Begrenzung um das mittlere Fach des Einsatzes mit einem schwarzen Permanentmarker mit einer ultrafeinen Spitze.
3. Seed: 3 x 10⁴ humane GABAerge Interneuronen im mittleren Kompartiment in 70 μl neuronalem Medium (Abbildung 1A).
4. 10⁴ humane periventrikuläre Endothelzellen in 70 μl periventrikuläres Endothelzellmedium und 10⁴ Kontrollendothelzellen in 70 μl Kontrollendothelzellmedium in den beiden äußeren Kompartimenten säen (Abbildung 1A).
5. Geben Sie 1 ml Co-Kulturmedium (50 % periventrikuläres Erhaltungsmedium ohne GABA und 50 % neuronales Medium) an der Seite der Schale, um ein Austrocknen der Beschichtung auf der Schale zu verhindern.
6. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob keine Zellen aus dem Einsatzfach austreten.
7. Die Zellen werden 24 h lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Überprüfen Sie nach einer 24-stündigen Inkubation unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen richtig anheftet haben und ob kein Leck vorliegt.
8. Entfernen Sie den Einsatz nach 48 Stunden Aussaat vorsichtig mit einer sterilen Pinzette. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellschicht nicht gestört ist (Tag 0).
9. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml frisches Co-Kulturmedium hinzu.
   HINWEIS: Legen Sie eine erforderliche Anzahl von Gerichten für Bilder von Tag 0 fest.
10. Die Zellen 36 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren. Nach 36 h Medium aspirieren, Zellen 10 min lang mit 4% PFA fixieren und 3x mit 1x PBS waschen.
11. Färben Sie humane GABAerge Interneuronen mit anti-humanen β-Tubulin- oder anti-humanen MAP2-Antikörpern. Am Ende des Färbevorgangs 1 ml Antifading-Eindeckmittel in jede Schale geben.

>2. Bildgebung und Datenanalyse

1. Stellen Sie die immungefärbte Assay-Schale unter ein Mikroskop mit 4-facher Vergrößerung.
2. Halten Sie eine lange Kante der rechteckigen Begrenzung (in Schritt 5.10 oben erstellt) im Sichtfeld. Nehmen Sie Bilder von Zellen im zellenfreien Raum auf, der an diese Grenze angrenzt. Erfassen Sie Bilder entlang der rechten langen Kante und der linken langen Kante der rechteckigen Grenze.
   HINWEIS: Zellen, die diagonal zum Rechteck positioniert sind, werden aufgrund von Mehrdeutigkeiten bei der Auswahl der kurzen oder langen Kante als Startmarke nicht berücksichtigt. Auch die Anzahl der Zellen, die über die kurze Kante wandern, ist oft signifikant geringer (möglicherweise aufgrund einer geringeren Anzahl von Startzellen entlang der kurzen Kante) und wird nicht berücksichtigt.
3. Öffnen Sie die Bilder in ImageJ. Berechnen Sie den Abstand zwischen den einzelnen Zellen und der Begrenzungsmarkierung mit ImageJ.
4. Um die Migration in Bezug auf die Zellzahl zu bewerten, legen Sie einen bestimmten Abstand von der Grenze im aufgenommenen Bild in ImageJ fest. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die sich innerhalb dieser Entfernung befinden. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl, Standard-Devia
5. und statistische Signifikanz mit geeigneter Software.

Ergebnisse

Abbildung 1: Chemo-Anziehungs-Assay. (A) Schema des Chemo-Attraction-Assays. Unter Verwendung eines Drei-Well-Kultureinsatzes wurden Interneurone (IN) in der Mitte ausgesät (grün gepunktetes Rechteck), während periventrikuläre Endothelzellen (PV ECs; orange gepunktetes Rechteck) und Kontrollendothelzellen (ECs; gelb gepunktetes Rechteck) auf beiden Seiten ausgesät wurden. (B) Bilder von β-Tubulin-...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kontrolle menschlicher Endothelzellen	Zelluläre Dynamik	Nr. R1022
Kontrolle der Endothelzellen Medium-Ergänzung	Zelluläre Dynamik	M1019
DMEMF/12 mittel	Thermofisher Scientific	11320033
E6 mittel	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronektin	Thermofisher Scientific	Artikel-Nr.: 33016-015
GABA	Sigma-Aldrich	Nr. A2129
Hämazytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Humane GABAerge Neuronen	Zelluläre Dynamik	Nr. R1013
Humane GABAerge Neuronen Basismedium	Zelluläre Dynamik	M1010
Menschliches GABAerges Neuron Neuronale Ergänzung	Zelluläre Dynamik	M1032
Laminin	Sigma	Nr. L2020
Einbettmedium	Vector Laboratorien	H-1200
Poly-L-Ornithin	Sigma	Seite 4957
Pbs	Thermofisher Scientific	Artikel-Nr.: 14190
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Komplettset	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Bestandteil des Kontrollmediums für humane Endothelzellen
3-Well-Silikonkultur-Einsatz	Ebd.	Artikel-Nr.: 80369
35 mm Schüssel	Corning	430165
4%ige PFA-Lösung	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Inverses Phasenkontrastmikroskop	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluoreszierendes Mikroskop	Olymp	FSX-100
Anti-Human-β-Tubulin-Antikörper	Biolegende	802001
Anti-MAP2-Antikörper	Neuromik	CH22103