Immunpräzipitation von Zielprotein-DNA-Komplexen aus Motoneuronen-Lysat

Zusammenfassung

Quelle: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in aus Mausstammzellen abgeleiteten Neuronen unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo). J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Immunpräzipitation von DNA-Fragmenten, die mit Zielprotein aus Stammzell-abgeleiteten Motoneuronen-Lysaten vernetzt sind, unter Verwendung von Zielprotein-spezifischen Antikörper-beschichteten Magnetbeads.

Protokoll

HINWEIS: Autoklaviertes destilliertes und deionisiertes Wasser (ddH₂O) wird für die Herstellung von Puffern und Reaktions-Mastermixen empfohlen.

>1. Zellen ernten und vernetzen

1. Nach der Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ES) der Maus in postmitotische Neuronen fügen Sie den geernteten Zellen 11 % Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 1 % (v/v) hinzu. Gesteinszellen auf einer Wippplattform (Wippe, Schüttler oder Rotator) für 15 min bei Raumtemperatur (RT, 25 °C).
   Anmerkung: Abhängig vom zu vernetzenden Zielprotein kann eine geringere Formaldehydvernetzung (z. B. eine Endkonzentration von 0,5 %) oder eine Doppelvernetzung mit Disuccinimidylglutarat (DSG) verwendet werden.
2. Fügen Sie 2,5 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 150 mM hinzu, um die Vernetzungsreaktion zu stoppen. Gesteinszellen auf einer Schaukelplattform bei RT, für 5 min.
3. Zentrifugieren Sie die vernetzten Zellen in konischen 15-ml-Röhrchen bei RT für 6 min bei 1.350 x g. Die Lösung aspirieren und dann die Zellen in 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendieren.
   Anmerkung: Die vernetzten Zellpellets können nach dem Schockfrosten mit flüssigem Stickstoff bei -80 °C gelagert werden.

>2. Zelllyse

HINWEIS: Die folgenden Schritte in diesem Protokoll gelten für ca. 2 x 10⁷ neuronale Zellen, die von Maus-ES-Zellen differenziert wurden. Um Zellen aufzubrechen, werden Lysepuffer verwendet, die verschiedene Detergenzien enthalten. Geben Sie kurz vor der Verwendung 50 μl 1000x vollständigen Proteaseinhibitor (CPI) in 50 ml Puffer

.

1. Bereiten Sie die Lysepuffer 1 bis 3 vor, wie in Tabelle 1 beschrieben.
2. Tauen Sie vernetzte Zellpellets auf Eis auf und resuspendieren Sie die Zellpellets dann gründlich in 3 ml Lysepuffer 1 in konischen 15-ml-Röhrchen. Schaukeln Sie bei 4 °C für 15 min auf einer schaukelnden Plattform. Bei 1.350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und Überstand aspirieren.
3. Die pelletierten Zellen werden gründlich in 3 ml Lysepuffer 2 resuspendiert. Bei 4 °C für 10 min auf einer Schaukelplattform schaukeln. Bei 1.350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und Überstand aspirieren.
4. Geben Sie 1 ml Lysepuffer 3 zu jedem Pellet und lassen Sie es dann auf Eis. Fahren Sie sofort mit der Beschallung fort.

>3. Beschallung des Chromatins

HINWEIS: Bewahren Sie die Proben während dieses Beschallungsverfahrens auf Eis oder bei 4 °C auf, um die Vernetzungsumkehr zu reduzieren.

1. Geben Sie mit einem sterilen Spatel Ultraschallkügelchen (Materialtabelle) bis zur 0,2-ml-Graduierung auf 15-ml-Polystyrolröhrchen auf. Waschen Sie die Ultraschallkügelchen durch Vortexen in 600 μl 1x PBS, bis keine trockenen Stellen mehr sichtbar sind. Die Röhrchen 5 s bei 30 x g zentrifugieren und 1x PBS aspirieren.
   Anmerkung: Die Beschallung in Polystyroltuben ist effizienter als die Beschallung in Polypropylentuben. Wenn eine kleinere Anzahl von Zellen (z. B. <10⁶ Zellen) beschallt wird, verwenden Sie 1,5-ml-Polystyrolröhrchen ohne Zugabe von Ultraschallkügelchen.
2. Die Kernlysate werden gründlich in 1 ml Lysepuffer 3 (aus Schritt 2.4) resuspendiert und dann in die 15-ml-Polystyrolröhrchen mit den Ultraschallkügelchen überführt. Die Styroporschläuche kurz durchwirbeln.
3. Um die vernetzte Chromatin-DNA zu fragmentieren, werden Kernlysate bei 4 °C für eine optimierte Anzahl von Zyklen beschallt, mit einer Leistungsamplitude von 30 W und Beschallungszyklen von 30 s an/30 s aus.
   Anmerkung: Die Optimierung der Beschallung für jeden Zelltyp und jede Charge führt zu der besten Ausbeute an Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-exo). Für 2 x 10⁷ neuronale Mauszellen fragmentieren 20-30 Ultraschallzyklen bei den genannten Einstellungen das Chromatin im Bereich von 100-500 bp.
4. Nachdem die Beschallung abgeschlossen ist, übertragen Sie alle Überstände (beschallte Lysate) aus jeder Probe in 1,5-ml-Röhrchen. Jede Probe wird mit 10 % 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol) in einer Endkonzentration von 1 % versorgt. Durch Pipettieren mischen.
5. Um Zellrückstände zu pelletieren, zentrifugieren Sie die Proben bei 13.500 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Übertragen Sie alle beschallten Lysate (Überstände) aus jeder Probe in neue 1,5-ml-Röhrchen.
6. Entnehmen Sie 30 μl beschalltes Lysat aus jeder Probe (~3% des beschallten Lysats) und geben Sie es in neue 1,5-ml-Röhrchen, um die Beschallung zu überprüfen. Lagern Sie die restlichen beschallten Lysate bei 4 °C, bis sie mit Antikörpern beschichteten Kügelchen inkubiert werden können.

>4. Überprüfung der Beschallung

1. Stellen Sie 20 ml 2x Proteinase K-Puffer her, indem Sie 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 6 ml autoklaviertes ddH₂O hinzufügen. Fügen Sie diesem Puffer keinen CPI hinzu. In einer 50-ml-Tube bei RT aufbewahren.
2. Um die Protein-DNA-Vernetzung durch Entfernen der Proteine umzukehren, nehmen Sie die 30 μl beschalltes Chromatin aus jeder Probe (aus Schritt 3.6), fügen Sie 166 μl autoklaviertes ddH₂O, 200 μl 2x Proteinase K-Puffer und 4 μl 20 mg/ml Proteinase K hinzu. Die Proben werden kurz vortexen und dann bei 65 °C für 1-3 h bei 24 x g inkubiert.
3. HINWEIS: Die beschallten Lysate können über Nacht bei 65 °C rückvernetzt werden.
4. Die DNA wird unter Verwendung von Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (PCIA: 25:24:1) und der Ethanolfällungsmethode wie folgt extrahiert
   Vorsicht: PCIA ist giftig. Verwendung unter einem Abzug mit der üblichen persönlichen Schutzausrüstung (PSA).
   1. Geben Sie 400 μl PCIA in 1,5-ml-Röhrchen zu jeder Probe, stellen Sie den Vortex auf maximale Geschwindigkeit ein und wirbeln Sie die Proben 20 s lang vortexen. Zentrifugieren Sie bei 18.400 x g für 6 min bei RT. Es werden zwei Phasen beobachtet. Übertragen Sie die obere wässrige Schicht (klare Phase) jeder Probe vorsichtig in neue 1,5-ml-Röhrchen.
   2. 1 μl 10 mg/ml RNase A zugeben. Proben 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
   3. Geben Sie 1 μl 20 mg/ml-Glykogen zu jeder Probe und fällen Sie es dann mit 1 mL eiskaltem 100%igem Ethanol aus (gelagert in einem -20 °C-Gefrierschrank). Kurz mischen, dann die Proben 30 min bis 1 h im -80 °C Tiefkühlschrank inkubieren. Proben bei 18.400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und vorsichtig 100 % Ethanol ausgießen.
   4. Waschen Sie die Pellets mit 500 μl eiskaltem 70%igem Ethanol (gelagert in einem -20 °C-Gefrierschrank). Bei 18.400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Vorsichtig 70 % Ethanol ausgießen.
   5. Die Proben werden in 1,5-ml-Röhrchen bei 50 °C inkubiert, bis das restliche Ethanol verdampft ist. Resuspendieren Sie DNA-Pellets in 15 μl autoklaviertem ddH2O oder nukleasefreiem ddH2O.
   6. Führen Sie die extrahierten DNA-Proben zusammen mit einer DNA-Leiter in einem 1,5%igen Agarosegel bei 120-180 V durch und überprüfen Sie die Größe der beschallten DNA.

>5. Antikörper-Inkubation mit Kügelchen

HINWEIS: Die folgenden Schritte in diesem Protokoll gelten für ca. 2 x 10⁷ neuronale Zellen, die von Maus-ES-Zellen differenziert wurden. Frieren und tauen Sie magnetische Beads zu keinem Zeitpunkt während des ChIP-exo-Protokolls ein, da die Beads reißen und eine Kontamination der Probe verursachen oder die Leistung des Antikörpers beeinträchtigt werden kann.

1. Bereiten Sie nach der Zelllyse und Beschallung die magnetischen Kügelchen von Protein G (Materialtabelle) für ChIP vor, mischen Sie die magnetischen Kügelchen, bis sie homogen sind, und geben Sie dann 25 μl magnetische Kügelchen in 2 ml-Protein-Low-Bind-Röhrchen.
   HINWEIS: Die Art der verwendeten magnetischen Kügelchen hängt von der Spezies der Antikörper ab.
2. Waschen Sie die Kügelchen mit 1 mL Blockierlösung (Tabelle 1), mischen Sie sie gut und legen Sie sie dann für 1 Minute auf ein Magnetgitter. Während Sie sich noch auf einem Magnetgestell befinden, entfernen Sie den Überstand, sobald er klar ist.
3. Geben Sie 1 ml Blockierungslösung zu den magnetischen Kügelchen. Gesteinsröhren für 10 min bei 4 °C auf einer Schaukelplattform. Kurz drehen, dann die Röhrchen auf ein Magnetgestell legen und den Überstand entfernen.
4. Wiederholen Sie Schritt 5.3 noch zwei weitere Male.
5. Geben Sie 500 μl Blockierungslösung zu magnetischen Beads. Schleudern Sie den Antikörper kurz gegen Isl1 (0,04 μg/μl, Materialtabelle) und geben Sie dann 4 μg Antikörper in die entsprechenden 2-ml-Protein-Low-Bind-Röhrchen, die die magnetischen Kügelchen in Blockierungslösung enthalten.
6. Wiederholen Sie Schritt 5.5 ohne Antikörper (d. h. die Kontrolle ohne Antikörper für ChIP).
   Anmerkung: Die Menge des hinzuzufügenden Antikörpers kann empirisch bestimmt werden, indem die Qualität des Antikörpers und die Anzahl der für ChIP verwendeten Zellen berücksichtigt werden.
7. Gesteinsproben bei 4 °C für 6−24 h auf einer Schaukelplattform.

>6. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Die mit
1. Antikörpern beschichteten Kügelchen aus Schritt 5.8 werden mit 1 ml Blockierungslösung gewaschen. Die Proben werden 5 Minuten lang bei 4 °C auf eine Schaukelplattform gelegt. Überstand entfernen.
2. Wiederholen Sie Schritt 6.1 noch zwei weitere Male.
3. Resuspendieren Sie die mit Antikörpern beschichteten Kügelchen in 50 μl Blockierungslösung und geben Sie sie dann in neue 2-ml-Proteinröhrchen mit geringer Bindung. Für jede ChIP-Probe werden beschallte Lysate (~1,0 mL aus Schritt 3.6) zu Antikörper-beschichteten Kügelchen in 2-ml-Protein-Low-Bind-Röhrchen gegeben.
4. Jede Probe wird über Nacht auf einer Wippplattform bei 4 °C inkubiert.

>7. ChIP wäscht

HINWEIS: Bewahren Sie Proben auf Eis oder bei 4 °C auf, um die Protein-DNA-Vernetzung während der ChIP-Waschungen aufrechtzuerhalten.

1. Stellen Sie einen Waschpuffer mit hohem Salzgehalt, einen LiCl-Waschpuffer und einen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) her, wie in Tabelle 2 beschrieben. In 50-ml-Röhrchen bei 4 °C lagern. Kurz vor der Verwendung 50 μl 1000x CPI-Material zu allen Puffern hinzufügen.
2. Drehen Sie die Proben kurz in 2-ml-Protein-Low-Bind-Röhrchen, um Flüssigkeit aus den Kappen zu sammeln, legen Sie sie dann 1 Minute lang auf ein Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
3. Für ChIP-Waschungen geben Sie 1 ml Lysepuffer 3 (bei 4 °C) in jedes Röhrchen. Auf einer Wippplattform bei 4 °C 5 Min. mixen. Die Proben kurz drehen, dann 1 Minute lang auf ein Magnetgestell legen und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
4. Geben Sie 1 ml kalten Waschpuffer mit hohem Salzgehalt in jedes Röhrchen. Auf einer Wippplattform bei 4 °C 5 Min. mixen. Die Proben kurz drehen, dann 1 Minute lang auf ein Magnetgestell legen und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
5. Geben Sie 1 mL kalten LiCl-Waschpuffer in jedes Röhrchen. Auf einer Wippplattform bei 4 °C 5 Min. mixen. Die Proben kurz drehen, dann 1 Minute lang auf ein Magnetgestell legen und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
6. Geben Sie 1 mL kalten 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) in jedes Röhrchen. Auf einer Wippplattform bei 4 °C 5 Min. mixen. Die Proben kurz schleudern, dann 1 min auf ein Magnetgestell legen und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
   Anmerkung: Anstelle von Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) kann Tris-EDTA-Puffer (pH 8,0) verwendet werden.

Tabelle 1: Rezepte für die Lysepuffer 1−3 und den Blockpuffer. In 50-ml-Röhrchen bei 4 °C lagern. Kurz vor der Verwendung 50 μl 1000x CPI (vollständiger Proteasehemmer) zu allen Puffern hinzufügen.

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

Lyse-Puffer 1
Reagenz	Volumen (ml)	[Finale]
1 M HEPES (pH 7,3)	2,5	50 mM
5 M NaCl	1,4	ca. 140 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
50% Glycerin	10	10 %
10% Octylphenolethoxylat	2,5	0,50 %
10% 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol	1,25	0,25 %
Autoklaviert ddH2O	Füllung bis 50
Lysepuffer 2
Reagenz	Volumen (ml)	[Finale]
0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)	1	ca. 10 mM
5 M NaCl	arabische Ziffer	ca. 200 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
Autoklaviert ddH2O	Füllung bis 50
Lysepuffer 3
Reagenz	Volumen (ml)	[Finale]
1 M Tris-HCl (pH 8,0)	0,5	ca. 10 mM
5 M NaCl	1	ca. 100 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
10% Desoxycholsäure	0,5	0,10 %
30% N-Lauroylsarcosin-Natriumsalzlösung	0,83	0,50 %
Autoklaviert ddH2O	Füllung bis 50
Blockierende Lösung
Reagenz	Menge	[Finale]
Rinderserumalbumin (BSA)	250 mg	0,50 %
Vollständiger Proteasehemmer (CPI, 1000x)	50 μL	1x
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Füllen auf 50 mL

Tabelle 2: Rezepte für ChIP-Waschungen: High Salt Wash Puffer, LiCl Wash Puffer und 10 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,4). In 50-ml-Röhrchen bei 4 °C lagern. Kurz vor der Verwendung 50 μl 1000x CPI-Material zu allen Puffern hinzufügen.

kg kg kg kg kg kg

Waschpuffer mit hohem Salzgehalt
Reagenz	Volumen (ml)	[Finale]
1 M HEPES (pH 7,3)	2,5	50 mM
5 M NaCl	5	500 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
10% 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol	5	1 %
5% Desoxycholsäure	1	0,10 %
5% Sicherheitsdatenblatt	1	0,10 %
Autoklaviert ddH2O	Füllung bis 50
LiCl Waschpuffer
Reagenz	Volumen (ml)	[Finale]
0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)	arabische Ziffer	ca. 20 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
1 M LiCl	12,5	ca. 250 mM
10% Octylphenolethoxylat	2,5	0,50 %
5% Desoxycholsäure	5	0,50 %
Autoklaviert ddH2O	Füllung bis 50
10 mM Tris-HCl Puffer
Reagenz	Volumen (ml)	[Finale]
1 M Tris-HCl (pH 7,4)	0,5	ca. 10 mM
Autoklaviert ddH2O	Füllung bis 50

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose, UltraPure	Invitrogen	16500	Überprüfung der Beschallung (Abschnitt 4.3.6)
Albumin, Rinderserum (BSA), proteasefrei, Hitzeschockisolation, min. 98%	BioShop	ALB003	Blockierende Lösung
Antikörper gegen Isl1	DSHB	39.3F7	Antikörperinkubation mit Kügelchen (Abschnitt 5.6)
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060010	Beschallung von Chromatin (Abschnitt 3.3)
Zentrifuge 5424 R	Eppendorf	5404000138	Beschallung des Chromatins (Abschnitt 3.5), Überprüfung der Beschallung (Abschnitt 4.3.1, 4.3.3 und 4.3.4)
Zentrifuge 5804 R	Eppendorf	22623508	Ernte, Vernetzung und Einfrieren von Zellen (Abschnitt 1.3), Zelllyse (Abschnitt 2.2 und 2.3), Beschallung des Chromatins (Abschnitt 3.1)
Kompletter, EDTA-freier Mini-Proteasehemmer-Cocktail	Roche	4693159001	Zu allen Puffern hinzugefügt, außer Proteinase K-Puffer und ChIP-Elutionspuffer
Desoxycholsäure-Natriumsalz	Fischer Wissenschaftlich	Nr. BP349	Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer und LiCl Wash Buffer
EDTA, 0,5 m, sterile Lösung, pH 8,0	BioShop	EDT111	Lysepuffer 1-3 zur Überprüfung der Beschallung (Abschnitt 4.1), High Salt Wash Puffer, LiCl Wash Puffer und ChIP Elution Puffer
Ethylalkohol wasserfrei, 100%	Kommerzielle Alkohole	P006EAAN	Überprüfen der Beschallung (Abschnitt 4.3.3)
Formaldehyd, 36,5-38%, enthält 10-15% Methanol	Sigma	Nr. F8775	Ernte-, Vernetzungs- und Gefrierzellen (Abschnitt 1.1)
Glycerin, Reagenzqualität, min. 99,5%	BioShop	GLY002	Lyse-Puffer 1
Glycin, biotechnologische Qualität, min. 99%	BioShop	GLN001	Ernte-, Vernetzungs- und Gefrierzellen (Abschnitt 1.2)
Glykogen, RNA-Qualität	Thermo Scientific	Nr. R0551	Überprüfen der Beschallung (Abschnitt 4.3.3)
HEPES, 1 m sterilfiltrierte Lösung, pH 7,3	BioShop	HEP003	Lysepuffer 1, Puffer mit hohem Salzgehalt
Lithiumchlorid (LiCl), Reagenzqualität	Bioladen	LIT704	LiCl Waschpuffer
Magnetische Kügelchen für ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (magnetische Kügelchen für ChIP)	Dynabeads Protein G (magnetische Kügelchen für ChIP)	Antikörperinkubation mit Kügelchen (Abschnitt 5)
Magnetisches Gestell (DynaMag-2 Magnet)	Invitrogen	12321D	Wird in vielen Schritten in den Abschnitten verwendet: 5
N-Lauroylsarcosin-Natriumsalzlösung, 30%ige wässrige Lösung, ≥97,0% (HPLC)	Sigma	Artikel-Nr.: 61747	Lyse-Puffer 3
Octylphenolethoxylat (IGEPAL CA630)	BioShop	NICHT999	Lysis Buffer 1 und LiCl Wash Buffer
Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol, biotechnologische Qualität (25:24:1)	BioShop	PHE512	Überprüfen der Beschallung (Abschnitt 4.3.1)
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x	Corning	21040CV	Ernte, Vernetzung und Einfrieren von Zellen (Abschnitt 1.3) und Beschallung von Chromatin (Abschnitt 3.1), Antikörperinkubation mit Kügelchen (Abschnitt 5.1)
PowerPac Basic Netzteil	BioRad	1645050	Überprüfung der Beschallung (Abschnitt 4.3.6)
Proteinase K-Lösung, RNA-Qualität	Invitrogen	25530049	Überprüfung der Beschallung (Abschnitt 4.2)
RNASE A-, Dnase- und Protease-frei	Thermo Scientific	EN0531	Überprüfung der Beschallung (Abschnitt 4.3.2)
Natriumchlorid (NaCl), BioReagenz	Sigma	Nr. S5886	Lysepuffer 1-3, Puffer mit hohem Salzgehalt
Natriumdodecylsulfat (SDS), Elektrophorese-Qualität	BioShop	SDS001 (Englisch	Überprüfung der Beschallung (Abschnitt 4.1), des High Salt Wash Puffers und des ChIP-Elutionspuffers
Beschallungsperlen und 15 mL Bioruptor-Röhrchen	Diagenode	C01020031	Beschalltes Chromatin (Abschnitt 3.1 und 3.2)
ThermoMischer F1.5	Eppendorf	5384000020	Abschnitte 4.2, 4.3.2 und 4.3.5
Trizma-Hydrochlorid-Lösung (Tris-HCl), BioPerformance-zertifiziert, 1 M, pH 7,4	Sigma	Nr. T2194	10 mM Tris-HCl Puffer
Trizma-Hydrochlorid-Lösung (Tris-HCl), BioPerformance-zertifiziert, 1 M, pH 8,0	Sigma	Nr. T2694	Lysepuffer 2, Lysepuffer 3, Überprüfung der Beschallung (Abschnitt 4.1), LiCl Wash Puffer und ChIP Elutionspuffer
VWR Mini Tube Wippe, variable Geschwindigkeit	VWR	Tel.: 10159-752	Wird in vielen Schritten in den Abschnitten 1, 2, 5, 6 und 7 verwendet
2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagenzqualität	BioShop	TRX506	Lysepuffer 1, beschalltes Chromatin (Abschnitt 3.4) und Puffer mit hohem Salzwaschgehalt

kg )