Fluoreszenz-Immunfärbung von zerebellären Organoidschnitten

Zusammenfassung

Quelle: Silva, T. P., et al., Skalierbare Generierung reifer Kleinhirn-Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunfärbung. J. Vis. (2020)

Dieses Video zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von Kleinhirn-Organoidschnitten, um spezifische Zielantigene zu identifizieren, die in verschiedenen Kleinhirnneuronen exprimiert werden und auf die Reifung von Organoiden hinweisen.

Protokoll

>1. Immunfärbung von Organoidscheiben

1. Legen Sie die Objektträger mit Organoidschnitten in ein Bekappglas mit 50 mL vorgewärmtem 1x PBS und halten Sie bis zu 10 Objektträger Rücken an Rücken.
   Anmerkung: Alle Organoidabschnitte sollten in Flüssigkeit getaucht werden.
2. 45 min bei 37 °C inkubieren, um die Objektträger zu entleimen.
3. 1x mit 50 mL 1× PBS für 5 min bei RT waschen: Übertragen Sie die Objektträger in ein Abdeckglas mit frischem 1× PBS.
4. Übertragen Sie die Objektträger in ein Verschließglas mit 50 ml frisch zubereitetem Glycin (Tabelle 1) und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
5. Übertragen Sie die Objektträger in ein Abdeckgefäß mit 50 ml 0,1 % Triton (Tabelle 1) und permeabilisieren Sie es 10 Minuten lang bei RT.
6. Mit 1× PBS 2x 5 min waschen.
7. Bereiten Sie die Immunfärbeschale mit 3 mm Papier vor, das in 1× PBS getränkt ist. Trocknen Sie die Objektträger mit einem Taschentuch um die Scheiben herum und legen Sie sie auf 3 mm Papier. Bedecken Sie mit einer Pasteurpipette die gesamte Oberfläche der Objektträger mit einer Blocklösung (Tabelle 1), 0,5 ml pro Objektträger. 30 Minuten bei RT inkubieren.
8. Entfernen Sie die überschüssige Blockierungslösung und trocknen Sie die Objektträger mit einem Taschentuch um die Scheiben herum. 50 μl des Primärantikörpers (Tabelle 2) in Blockierungslösung verdünnt über die Schnitte geben und mit den Deckgläsern abdecken. Legen Sie die Scheiben in eine zuvor vorbereitete Immunfärbeschale. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
9. Übertragen Sie die Objektträger mit 50 mL TBST in ein Abdeckglas (Tabelle 1), lassen Sie die Deckgläser fallen und waschen Sie sie 3x 5 min lang mit TBST.
10. 50 μl des in Blockierlösung verdünnten Sekundärantikörpers über die Schnitte geben und mit den Deckgläsern abdecken. Legen Sie die Scheiben in die zuvor vorbereitete Immunfärbeschale. 30 min bei RT lichtgeschützt inkubieren.
11. Übertragen Sie die Objektträger wieder in ein Abdeckglas und waschen Sie sie mit 50 mL TBST für 5 min 3x.
12. Trocknen Sie die Objektträger mit einem Taschentuch um die Scheiben herum und legen Sie die Scheiben in eine zuvor vorbereitete Immunfärbeschale. Geben Sie mit einer Pasteurpipette 0,5 ml DAPI-Lösung über die gesamte Oberfläche der Objektträger. 5 min bei RT inkubieren.
13. Wiederholen Sie Schritt 1.9.
14. Trocknen Sie die Objektträger vorsichtig mit einem Taschentuch ab. Geben Sie 50 μl Einbettmedium Tropfen für Tropfen entlang des Objektträgers und senken Sie dann vorsichtig ein Deckglas auf jeden Objektträger ab, indem Sie es leicht biegen, um Blasen zu vermeiden.

Tabelle 1: Lösungen zur Herstellung von Organoiden für die Kryosektion und Immunfärbung. Aufgelistet sind alle Komponenten und Volumina, die zur Herstellung der Lösungen verwendet werden, die bei der Herstellung von Organoiden für die Kryosektion und Immunfärbung verwendet werden.

Gelatine/Saccharose Endkonzentration: 7,5 %/15 Gew.-%	1. 15 g Saccharose und 7,5 g Gelatine in einer sterilen Schott Glasflasche abwiegen und gut vermischen 2. PBS 1x bei 65 °C vorwärmen 3. Vorgewärmtes PBS 1x bis zu einem Endgewicht von 100 g zugeben und gut verrühren 4. Stellen Sie die Schott Glasflasche in eine Heizplatte bei 65 °C und schütteln Sie, bis die Gelatine schmilzt 5. Bei 37 °C inkubieren, bis sich die Lösung stabilisiert hat
Glycin Endkonzentration: 0,1 M	Fügen Sie 0,37 g Glycin zu 50 ml frisch zubereitetem PBS 1x hinzu.
Triton solution Endkonzentration: 0,1 Gew.-%	1. Bereiten Sie eine 10 % Triton X-100 Brühe vor: 5 g Triton X-100 in 50 mL PBS 1x 2. Fügen Sie 0,5 mL Triton X-100 Stamm zu 50 mL PBS 1x hinzu.
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % w/v Tween-20	20 mL Tris 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (10 % Stamm: 5 g Tween-20 in 50 mL Wasser) Bis zu 1 L mit Wasser füllen.
Blockierende Lösung	5 ml fötales Rinderserum (FBS, Endkonzentration: 10 % v/v) zu 50 ml TBST hinzufügen.
DAPI-Lösung	Fügen Sie 15 μl DAPI-Stammlösung (1 mg/ml) zu 10 mL destilliertem Wasser hinzu
Mowiol	1. 2,4 g Mowiol auf 6 g Glycerin zugeben und 1 h in einer vorgewärmten Platte bei 50 °C 2. Fügen Sie 6 ml destilliertes Wasser hinzu und schütteln Sie es für 2 h 3. 12 mL Tris 200 mM (pH 8,5) hinzufügen und 10 min schütteln 4. Bei 5.000 × g 15 Minuten zentrifugieren5. Aliquotieren und bei -20 °C lagern.

Tabelle 2: Primäre Antikörper. Die primären Antikörper, Klone und optimierten Verdünnungen, die für die Immunfärbung verwendet werden, sind aufgeführt.

Blatt Blatt Blatt

Antikörper	Wirtsarten	Verdünnung
BARHL1	Kaninchen	1/500
CALBINDIN	Kaninchen	1/500
MAP2	Maus	1/1000
N-CADHERIN	Maus	1/1000
NESTIN	Maus	Nr. 1/400
OLIG2	Kaninchen	1/500
PAX6	Kaninchen	Nr. 1/400
SOX2	Maus	Nr. 1/200
TBR1	Kaninchen	Nr. 1/200
TBR2	Kaninchen	Nr. 1/200
TUJ1	Maus	1/1000

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3MM Papier	WHA3030861	Merck
Anti-BARHL1 Antikörper	HPA004809	Atlas Antikörper
Anti-Calbindin D-28k Antikörper	CB28	Millipore
Anti-MAP2-Antikörper	M4403	Sigma
Anti-N-Cadherin-Antikörper	610921	BD-Transduktion
Anti-NESTIN Antikörper	MAB1259-SP	Forschung und Entwicklung
Anti-OLIG2-Antikörper	MABN50	Millipore
Anti-PAX6-Antikörper	PRB-278P	Sehenswürdigkeit
Anti-SOX2-Antikörper	MAB2018	Forschung und Entwicklung
Anti-TBR1-Antikörper	AB2261	Millipore
Anti-TBR2-Antikörper	Artikel-Nr.: ab183991	Abcam (Englisch
Anti-TUJ1 Antikörper	801213	Biolegende
Deckgläser 24x60mm	Nr. 631-1575	VWR
DAPI	10236276001	Sigma
Fötales Rinderserum	A3840001	ThermoFisher
Gelatine aus Rinderhaut	Nr. G9391	Sigma
Glas-Abdeckglas	Nr. E94	ThermoFisher
Glycin	MB014001	NZYtech
Monothioglycerin	Nr. M6154	Sigma
Mowiol	475904	Millipore	Einbettmedium
Triton X-100	Artikel-Nr.: 9002-93-1	Sigma
Tween-20	Nr. P1379	Sigma
SuperFrost Objektträger	12372098	ThermoFisher	Adhäsions-Objektträger

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