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>1. Herstellung von zerebralen Organoiden aus iPSC / hESC 2D-Kultur (Tag 0)
Hinweis: Dieses Protokoll geht davon aus, dass die Stammzellerhaltung (SC) in xenofreien Stammzellerhaltungsmedien (SCMM) mit einem Vitronektin- oder Geltrex-Substrat durchgeführt wird. Bei Verwendung eines alternativen, proteinreichen Stammzellkulturmediums ist es ratsam, SC-Kulturen für mindestens zwei Durchgänge auf SCMM umzustellen, bevor mit der Organoidbildung begonnen wird. Das Protokoll wurde nicht mit Feeder-basierten SC-Kulturmethoden getestet.
- Bringen Sie die Kulturen mit regelmäßigen SC-Wartungsmethoden auf 50 % bis 70 % Konfluenz. Dies ist in der Regel 3-4 Tage nach der Passage, kann jedoch von der Kulturmethode und der Zelllinie abhängen.
Anmerkung: Ungefähr 2 Wells von einer 6-Well-Platte werden benötigt, um eine vollständige 96-Well-Platte mit Organoiden herzustellen.
- Inspizieren Sie Kulturen mittels Hellfeldmikroskopie bei 10-facher Vergrößerung, um eine gesunde Koloniemorphologie ohne nachweisbare Differenzierung zu gewährleisten.
- Bringen Sie SCMM in einem heißen Wasserbad auf 37 °C und tauen Sie ein 50-μl-Fläschchen mit 50 mM Y-27632 (Gesteinsinhibitor) und 2 ml enzymatisches Ablösereagenz auf Raumtemperatur auf.
- Bereiten Sie eine ULA-Platte mit U-Boden (96 Wells), eine Mehrkanalpipette P200 und ein 25-ml-Reagenzreservoir vor.
- Aliquotieren Sie 45 mL SCMM in einem konischen 50-ml-Röhrchen und fügen Sie 45 μl 50 mM Y-27632 hinzu. Gründlich mischen, indem man verreibt.
- Aspirieren Sie die beiden Vertiefungen mit SCs im Vakuum und geben Sie mit einer P1000-Pipette schnell 1 ml enzymfreies Ablösereagenz in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C heißen Inkubator für 4 min.
- Saugen Sie die behandelten Vertiefungen vakuuman und geben Sie mit einer P1000-Pipette 1 ml enzymatisches Ablösereagenz in jede Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C heißen Inkubator für weitere 5 Minuten.
- Entfernen Sie die Platte und untersuchen Sie die behandelten Vertiefungen. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um aggregierte Zellen aufzubrechen. Wenn noch große Zellcluster sichtbar sind, inkubieren Sie die Platte für weitere 2 Minuten bei 37 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Cluster mit bloßem Auge nicht mehr sichtbar sind.
- Sobald die Zellen richtig dissoziiert sind, fügen Sie 1 ml SCMM zu jeder Vertiefung hinzu, um die Dissoziationsenzyme zu deaktivieren. Bündeln Sie die 4 ml Zellsuspension in einem konischen 50-ml-Röhrchen und entnehmen Sie ein kleines Aliquot für die Zellzählung.
- Bringen Sie die verbleibenden, unbehandelten Vertiefungen in der Wartungsplatte wieder in den 37 °C-Inkubator zurück.
- Während des Zählens zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min.
- Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen und berechnen Sie die Menge an SCMM + Y-27632-Lösung, die benötigt wird, um eine Suspension von 60.000 Zellen/ml zu erreichen.
- Den Überstand vorsichtig vakuumieren und das berechnete Volumen der Lösung SCMM + Y-27632 hinzufügen. 5-10 Mal mit einer 5-ml-Pipette mischen, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten.
- Übertragen Sie die Zellsuspension sofort in ein Reagenzreservoir und pipettieren Sie 150 μl mit einer Mehrkanalpipette P200 in jede Vertiefung der ULA U-Boden 96-Well-Platte. Dabei entstehen 96 einzelne Organoide, die zunächst aus jeweils 9.000 Zellen bestehen.
- Die Platte bei 150 x g 1 min zentrifugieren.
- Stellen Sie die Platte in einen 37 °C heißen Inkubator und stören Sie die Platte 48 Stunden lang nicht.
>2. Zerebrale Organoid-Pflege (Tag 2)
- Bereiten Sie 17 mL SCMM mit 17 μl 50 mM Y-27643 in einem konischen 50-ml-Röhrchen vor. Erwärmen Sie die Lösung SCMM + Y-27632 in einem heißen Wasserbad auf 37 °C.
- Nehmen Sie die Organoidplatte aus dem Inkubator und ziehen Sie mit einer auf 75 μl eingestellten Mehrkanalpipette P200 langsam das Medium vom Rand der Vertiefung in der ersten Reihe auf. Sobald das Medium gezogen wurde, stoßen Sie das Medium schnell wieder in die Vertiefung aus, um lose Zellen und Organoide anzuheben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zeile.
Anmerkung: Diese Technik, die im Folgenden als "Dispersion" bezeichnet wird, hebt Zelltrümmer und das Organoid in Suspension. Das Organoid sinkt schnell auf den Boden des Bohrlochs, während die kleineren Ablagerungen in der Schwebe bleiben, so dass sie mit einem Medienwechsel entfernt werden können. Dies trägt dazu bei, dass das Organoid während der Kultur nicht in Zelltrümmern verbleibt.
- Nachdem alle Vertiefungen verteilt wurden, warten Sie 15 s, um sicherzustellen, dass die Organoide auf den Boden jeder Vertiefung gesunken sind.
- Saugen Sie langsam und vorsichtig 75 μl Medium aus jeder Vertiefung mit der Mehrkanalpipette P200 ab und geben Sie es in ein Abfallreservoir.
Anmerkung: Die meisten Anwender aspirieren gelegentlich ein Organoid während der regelmäßigen Fütterung. Dies kann in etwa 1% der Fälle der Fall sein. Bitte planen Sie entsprechend, um sicherzustellen, dass genügend Organoide bis zu experimentellen Zeitpunkten überleben.
- Übertragen Sie die SCMM + Y-27632-Lösung in ein Reagenzreservoir und dispensieren Sie 150 μl in jede Organoid-Vertiefung mit der Mehrkanalpipette P200.
- Stellen Sie die Platte wieder in einen 37 °C heißen Inkubator.
>3. Zerebrale Organoid-Aufrechterhaltung (Tag 3)
- 17 mL SCMM auf 37 °C erwärmen, diesmal ohne Y-27643.
- Dispergieren Sie mit der Mehrkanalpipette P200 auf 100 μl alle Vertiefungen der Organoidplatte (siehe Schritt 2.2). Warten Sie 15 Sekunden, um sicherzustellen, dass die Organoide auf den Boden ihrer Vertiefungen gesunken sind.
- Bereiten Sie ein Abfallreservoir vor und überführen Sie das erwärmte SCMM in ein Quellreservoir
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- Saugen Sie vorsichtig 125 μl Medium aus jeder Vertiefung ab und ersetzen Sie es mit der Mehrkanalpipette P200 durch 150 μl frisches SCMM.
- Stellen Sie die Platte wieder in einen 37 °C heißen Inkubator.
>4. Zerebrale Organoid-Aufrechterhaltung (Tag 4+)
Hinweis: Führen Sie diese regelmäßige Wartung jeden zweiten Tag bis zur Infektion durch.
- Bevor Sie mit der Fütterung an Tag 4 beginnen, bereiten Sie das neuronale Induktionsmedium (NI) vor.
- Tauen Sie ein 250-μl-Aliquot von 2 mg/ml Heparin zusammen mit einer 5-ml-Durchstechflasche mit 100X N-2-Supplement auf. Fügen Sie die 250 μl Heparin, 5 ml 100x N-2 und 5 ml mindestens 100x essentielle medium-nicht-essentielle Aminosäuren (MEM-NEAA) zu 500 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium/Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12) + GlutaMAX hinzu. Die gemischte Lösung wird in einem 500-ml-Filter sterilfiltriert.
Hinweis: Halten Sie NI bei Nichtgebrauch bei 4 °C. NI hält bis zu zwei Wochen an, bevor frisches Medium zubereitet werden sollte.
- 17 ml NI-Medium auf 37 °C erwärmen.
- Dispergieren Sie mit der Mehrkanalpipette P200 auf 100 μl alle Vertiefungen der Organoidplatte (siehe Schritt 2.2). Warten Sie 15 Sekunden, um sicherzustellen, dass die Organoide auf den Boden ihrer Vertiefungen gesunken sind.
- Bereiten Sie ein Abfallreservoir vor und überführen Sie das erwärmte NI in ein Quellreservoir
.
- Aspirieren Sie vorsichtig 125 μl Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es mit der Mehrkanalpipette P200 durch 125 μl frisches NI.
- Stellen Sie die Platte wieder in einen 37 °C heißen Inkubator.
>5. Organoide Infektion mit dem Zika-Virus (ZIKV) (~Tag 24)
HINWEIS: Nach etwa 3 Wochen der Differenzierung sind innerhalb des Organoids große neuroepitheliale Strukturen und Rosetten sichtbar, die sehr anfällig für eine ZIKV-Infektion sind.
- Bringen Sie Earles 1X Balanced Salt Solution (EBSS), 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und NI in einem heißen Wasserbad auf 37 °C.
- Verdünnen Sie ZIKV der bekannten Konzentration in 1X EBSS auf die Zielinfektionsmultiplicity of Infection (MOI).
Anmerkung: Titrationen verschiedener MOIs werden empfohlen, um eine virale Dosisreaktion zu erreichen. Dies kann je nach Virusstamm variieren. für ATCC VR-1838 und ATCC VR-1843 liegen die typischen MOI-Werte zwischen 0,1 und 10).
- Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Medium mit einer Einkanalpipette P200 aus der Organoidvertiefung. Geben Sie schnell 200 μl 1X PBS in jede Vertiefung, indem Sie eine P200-Mehrkanalpipette verwenden, um die Organoide zu waschen.
- Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Medium mit einer Einkanalpipette P200 aus der Organoidvertiefung. Geben Sie schnell 50 μl 1X EBSS-only (Scheininfektion) oder ZIKV-Viruslösung in die Vertiefung und stellen Sie sicher, dass das Organoid vollständig untergetaucht ist. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Organoid, das für die Studie infiziert werden soll.
- Stellen Sie die Platte wieder für 2 h.
in einen 37 °C heißen Inkubator
Anmerkung: Die Inkubation von scheininfizierten Organoiden für diese Dauer sollte ihr Wachstum im Vergleich zu ungestörten Organoiden nicht signifikant beeinträchtigen.
- Etwa 30 Minuten vor Abschluss der Virusinkubation aliquotieren Sie 25 ml NI in ein konisches 50-ml-Röhrchen und bringen es in einem heißen Wasserbad auf 37 °C.
- Nachdem die Virusexposition abgeschlossen ist, waschen Sie die Organoide mit 200 μl 1X PBS für jede Vertiefung, lassen Sie die Organoide 15 s lang absetzen und entfernen Sie dann 1X PBS mit einer Einkanalpipette P200.
- Geben Sie 200 μl frisches NI in jede Vertiefung und geben Sie sie wieder in den Inkubator.
- Optional: Für einen Zeitpunkt von Tag 0 können Organoide eine Stunde nach der Infektion abgebildet werden.
- Setzen Sie die Kultur fort, indem Sie alle zwei Tage 125 μl NI mit der Dispersionsmethode ersetzen (siehe Schritt 4). Achten Sie darauf, verbrauchte Medien und Spitzen ordnungsgemäß zu entsorgen, da diese infektiöse ZIKV-Partikel enthalten.