Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit in einer Kleinhirn-Neuronenkultur mittels Doppelfärbung

Zusammenfassung

Quelle: Jiajia, L., et al. Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit mittels Fluorescein-Diacetat-Propidiumiodid-Doppelfärbung in zerebellärer Granula-Neuronenkultur. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video zeigt die Methode zur Identifizierung von Neuronen aus einer Mischkultur aus Kleinhirn-Körnerneuronen und Gliazellen unter Verwendung der dualen Färbung mit Fluoresceindiacetat (FDA) und Propidiumiodid (PI), wobei lebende Neuronen grün und tote Neuronen rot erscheinen.

Protokoll

>1. FDA-PI Doppelfärbung und in zerebellären Granula Neuron (CGN) Kultur

Bereiten Sie die
1. Arbeitslösung für Fluoresceindiacetat-Propidiumiodid (FDA-PI) vor, indem Sie 20 μl FDA-Stammlösung (Endkonzentration: 10 μg/ml) und 50 μl PI-Stammlösung (Endkonzentration: 50 μg/ml) in 10 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzufügen. Mixen Sie es durch Vortexen und legen Sie es auf Eis.
   Anmerkung: Bereiten Sie die Arbeitslösung FDA-PI Arbeitslösung kurz vor Gebrauch frisch vor.
2. Nehmen Sie die Zellkulturplatte aus dem Inkubator. Legen Sie es auf Eis.
3. Aspirieren Sie das Nährmedium und ersetzen Sie es durch kaltes PBS.
   Anmerkung: Der Wechsel der Lösung muss langsam und vorsichtig erfolgen. Vermeiden Sie es, die Zellen mit Pipettenspitzen zu berühren.
4. Aspirieren Sie das kalte PBS und ersetzen Sie es durch kaltes FDA-PI (500 μl/Well für 12-Well-Zellkulturplatten oder 1 mL/Well für 6-Well-Zellkulturplatten). 5 Min. auf Eis gehen lassen.
5. Aspirieren Sie den FDA-PI und fügen Sie kaltes PBS hinzu (100 μl/Vertiefung für 12-Well-Zellkulturplatten oder 50 μl/Vertiefung für 6-Well-Zellkulturplatten).
   Anmerkung: Zellen sollten bei der Aufnahme von Bildern nicht trocknen gelassen werden.
6. Nehmen Sie Bilder mit Fluoreszenzmikroskopie auf. Verwenden Sie einen Anregungsfilter mit einem Durchlassbereich von 450 - 490 nm. Detektieren Sie die Fluoreszenzemissionen für FDA und PI bei 520 nm bzw. 620 nm. Nehmen Sie unter den gleichen Bedingungen ein Bild unter normalem Licht mit dem Phasenkontrastmodus der Fluoreszenzmikroskopie auf.
   Anmerkung: Nehmen Sie Bilder innerhalb von 15 Minuten nach der FDA-PI auf. Die Belichtungszeit beträgt 100-300 ms, die analoge Verstärkung das 2,8-fache.

>2. Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit

1. Für die FDA-PI-Doppelfärbung überlagern Sie die Bilder der Zellen, die nach dem Filtern mit verschiedenen Fluoreszenzfiltern erkannt wurden, indem Sie die FDA-positive Schicht auf die PI-positive Schicht in der Grafikeditor-Software ziehen.
   1. Passen Sie die Deckkraft der FDA-positiven Ebene an, indem Sie "50 %" in das Feld "Deckkraft" des Bedienfelds "Ebenen" eingeben. Führen Sie zwei Ebenen zusammen, indem Sie im Menü "Ebene" auf die Schaltfläche "Sichtbare zusammenführen" klicken. Stellen Sie den Kontrast der Overlay-Bilder ein, indem Sie "50" in das Feld "Kontrast" unter "Bild"| "Anpassungen" | "Helligkeit/Kontrast." Stellen Sie sicher, dass die Overlay-Bilder keine doppelt positiven Zellen von FDA und PI enthalten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fötales Rinderserum	Gibco	10099141	hochwertige FBS ist essentiell für die Kultur
100× Glutamin	Gibco	25030081
100× Antibiotikum	Gibco	15240062
BME mittel	Gibco	21010046
Fluoresceindiacetat	Sigma	Nr. F7378
Propidiumiodid	Sigma	Nr. P4170
Kaninchen Anti-GAP43 Antikörper	Abcam (Englisch	AB75810
Maus Anti-GFAP Antikörper	Zelluläre Signalübertragung	Nr. 3670
Pasteur-Pipette	Volac	Z310727	Brennen Sie die Spitze vor Gebrauch rund
6-Well-Zellkulturplatten	Wärmekraftwerk	Z707759	Hochwertige Zellkulturplatte ist für die Kultur unerlässlich
Filter	Millipore	SLGP033RB
Pipette 5 ml	Hervorragende Biografie	Artikel-Nr.: CS017-0003
Pipette 10 ml	Hervorragende Biografie	Artikel-Nr.: CS017-0004
CO2-Inkubator	Thermo Scientific	311
Fluoreszenz-Mikroskop	Nikon	TI-S
Fluoreszenzfilter und Emmisionswürfel	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Foto-Software	Nikon	NIS-Elemente
Grafikeditor Software	Lehmziegel	Photoshop CS
Software für die Bildbearbeitung	Nih	BildJ

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