Visualisierung von Pilzkörperneuronen in Drosophila-Gehirnen durch Immunfärbung

Zusammenfassung

Quelle: Kelly, S. M., et al. Dissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Pilzkörper- und Photorezeptorneuronen in adulten Drosophila melanogaster-Gehirnen. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video zeigt ein detailliertes Immunfärbeprotokoll zur Visualisierung phänotypischer Defekte in den Pilzkörpern mutierter Drosophila-Gehirne. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung von Antikörpern gegen Fas2, ein Protein, das an der axonalen Führung beteiligt ist und die richtige morphologische und funktionelle Entwicklung des Pilzkörpers erleichtert.

Protokoll

>1. Verfahren zur Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung

1. Übertragen Sie mit einer p200-Pipette präparierte Gehirne aus der 9-Well-Schale in ein 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 0,5 ml 4 % Paraformaldehyd gefüllt ist, verdünnt in PTN (0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, 0,1 % nichtionisches Tensid). Mindestens 10 - 15 Gehirne des gleichen Genotyps können in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert werden. Alle restlichen Schritte (bis zur Montage des Gehirns auf Objektträger) werden in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt.
   Vorsicht: Paraformaldehyd (PFA) sollte in einem Abzug gehandhabt werden. PFA-Abfälle sollten aufbewahrt und ordnungsgemäß entsorgt werden. Zwanzig Prozent des in Glasampullen gekauften Paraformaldehyds können in Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden.
2. Inkubieren Sie das Gehirn in einem Abzug 20 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd unter langsamem Schaukeln bei Raumtemperatur.
3. Lassen Sie das Gehirn nach der Fixierung durch die Schwerkraft am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens absetzen.
   Anmerkung: Gelegentlich kann es vorkommen, dass das Gehirn an der Seite des Mikrozentrifugenröhrchens kleben bleibt. In diesem Fall ist es in der Regel hilfreich, den Schlauch zwischen Zeigefinger und Daumen seitlich zu drehen oder den Schlauch sanft auf die Bank zu klopfen, um das Absinken des Gehirns zu fördern.
4. Entfernen Sie das Fixiermittel mit einer p1000-Pipette und führen Sie zwei "schnelle" Waschgänge mit 500 μl PTN durch, damit sich das Gehirn zwischen den Waschgängen am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens absetzen kann. Während dieser schnellen Wäschen kann das PTN, sobald sich alle Gehirne durch die Schwerkraft auf dem Boden des Mikrozentrifugenröhrchens abgesetzt haben, sofort gegen frischen Puffer ausgetauscht werden. Es ist keine zusätzliche Waschzeit erforderlich.
   Anmerkung: In der Regel ist es besser, zusätzlichen Puffer in der Röhre zu belassen, als eine Gehirnentfernung zu riskieren. Eine sorgfältige Untersuchung der Pipettenspitze ist oft erforderlich, um sicherzustellen, dass kein Gehirn versehentlich aus dem Röhrchen entfernt wurde. Wenn Gehirne versehentlich in die Spitze pipettiert wurden, geben Sie sie zurück in das Mikrozentrifugenröhrchen, warten Sie, bis sich das Gehirn beruhigt hat, und entfernen Sie dann weiterhin das verbleibende PTN.
5. Verwenden Sie nach der letzten schnellen Wäsche eine p1000-Pipette, um drei "lange" Wäschen durchzuführen: Fügen Sie 500 μl PTN hinzu und waschen Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe/einem Nutator. Alle zukünftigen "langen" Wäschen sollten 20 Minuten dauern.
   Anmerkung: Fixierte Gehirne können nach diesen Wäschen über Nacht bei 4 °C in PTN gelagert werden.
6. Entfernen Sie die letzte Wäsche mit einer p1000-Pipette und inkubieren Sie das Gehirn auf einer Wippe oder einem Nutator bei Raumtemperatur in 0,5 ml Blockierungslösung [PTN + 5% normales Ziegenserum (NGS)] für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur.
   1. In den nachfolgenden Protokollschritten werden Ziegen-Sekundärantikörper verwendet. Wenn Sekundärantikörper einer anderen Spezies verwendet werden, sollte normales Serum dieser Spezies (anstelle von NGS) in der Blockierungs- und Antikörperlösung verwendet werden.
7. Entfernen Sie mit einer p1000-Pipette die Blockierungslösung und fügen Sie den in PTN verdünnten Primärantikörper (PTN + 5 % NGS + verdünnter Primärantikörper) hinzu. Bei der erstmaligen Verwendung eines Primärantikörpers sollte die optimale Verdünnung dieses Antikörpers empirisch bestimmt werden.
   Anmerkung: Zur Visualisierung von Pilzkörperneuronen werden typischerweise Antikörper verwendet, die Fas2 erkennen. Diese Antikörper sind von der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) als Antikörper 1D4 erhältlich und sollten 1:20 in PTN + 5% NGS verdünnt werden.
8. Inkubieren Sie das Gehirn in einer primären Antikörperlösung auf einer Wippe/einem Nutator für 2 - 3 Nächte bei 4 °C.
9. Lassen Sie das Gehirn nach der Inkubation mit Primärantikörpern auf dem Boden des Mikrozentrifugenröhrchens absetzen und entfernen Sie dann die Primärantikörperlösung.
10. Führen Sie mit einer p1000-Pipette 2 "schnelle" Waschgänge und 3 "lange" 20-minütige Waschgänge mit 0,5 ml PTN durch, wie oben in den Schritten 1.4 und 1.5 beschrieben, wobei Sie das Gehirn zwischen jedem Waschgang vorsichtig durch die Schwerkraft am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens absetzen lassen.
11. Inkubieren Sie das Gehirn 3 h lang bei Raumtemperatur mit geeigneten fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern. Sekundärantikörper werden in der Regel in 0,5 ml PTN + 5 % NGS in einer Konzentration von 1:200,
    Anmerkung: Nachdem fluoreszierende Sekundärantikörper hinzugefügt wurden, sollten die Gehirne für den Rest des Experiments im Dunkeln gelassen werden.
12. Lassen Sie das Gehirn nach der Inkubation des Sekundärantikörpers am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens absetzen und entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung.
13. Führen Sie 2 "schnelle" Waschgänge und 3 "lange" 20-minütige Waschgänge mit 0,5 ml PTN durch, wie oben in den Schritten 1.4 und 1.5 beschrieben, und lassen Sie das Gehirn zwischen jedem Waschen vorsichtig am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens absetzen.
14. Nach dem dritten "langen" 20-minütigen Waschen verwenden Sie eine p200-Pipette, um so viel Puffer wie möglich zu entfernen.
15. Geben Sie 75 μl fluoreszierendes Anti-Fade-Eindeckmedium in das Gehirn. Pipettieren Sie das Gehirn und das Einbettmedium einmal in die Pipettenspitze, um es zu mischen. Drehen Sie das Röhrchen nicht um, da das Gehirn an der Kappe oder den Seiten des Mikrozentrifugenröhrchens stecken bleiben kann.
    Anmerkung: Nach der Suspension des Gehirns in Einbettmedium können die Röhrchen in Aluminiumfolie eingewickelt werden, um das Abschrecken der Fluorophore zu verlangsamen, und über Nacht bei 4 °C gelagert werden. Bei Bedarf kann das Gehirn mehrere Tage bei 4 °C gelagert werden, sollte aber idealerweise so schnell wie möglich auf Objektträger montiert werden.

>2. Montage von adulten D. melanogaster-Gehirnen auf Objektträger und Bildgebung

1. Baue eine "Brücken"-Rutsche. Positionieren Sie zwei "Basis"-Deckgläser im Abstand von ca. 1 cm auf einem positiv geladenen Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die positiv geladene Seite des Objektträgers nach oben zeigt. Kleben Sie die Deckgläser mit Fingernagellack auf die Folie, wie in Abbildung 1A gezeigt. Das Abdichten der drei Außenkanten jedes Unterlagenabdecks mit Fingernagellack ist in der Regel hilfreich, um sicherzustellen, dass Eindeckmedien nicht unter diesen Unterlagenabdeckgläsern ableiten. Lassen Sie den Fingernagellack vollständig trocknen (10 - 15 min), bevor Sie fortfahren.
2. Legen Sie den Objektträger unter das Stereomikroskop und pipettieren Sie die Eindeckmedienlösung mit den präparierten Gehirnen in den Raum zwischen den beiden Deckgläsern. Um für mehr Kontrast zu sorgen, ist es hilfreich, die Schwanenhalsleuchten so zu manövrieren, dass sie parallel zur Tischplatte stehen.
3. Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium mit einer Pipette vom Objektträger und achten Sie darauf, das Gehirn nicht vom Objektträger zu pipettieren.
4. Leiten Sie überschüssige Eindeckmedien ab. So können die Gehirne im nächsten Schritt genauer positioniert werden.
5. Positionieren Sie das Gehirn mit einer Pinzette und dem Stereomikroskop in einem Gittermuster auf dem Objektträger, wobei die Antennenlappen nach oben zeigen.
6. Legen Sie ein Deckglas (die "Brücke") über das Gehirn (Abbildung 1A). Verwenden Sie Fingernagellack, um die Seiten des Brückenabdeckschlaufens an der Stelle zu versiegeln, an der sie mit den "Basis"-Abdeckschiebern in Kontakt kommen.
7. Füllen Sie mit einer p200-Pipette den mittleren Hohlraum unter der Brücke langsam mit frischem Einbettmedium (Abbildung 1B). Legen Sie einen Tropfen nach dem anderen auf die offene Kante des mittleren Deckglases und lassen Sie das Montagemedium unter dem mittleren Deckglas des Stegs hindurchgleiten. Fahren Sie fort, bis der gesamte Hohlraum mit Eindeckmedien gefüllt ist, und versiegeln Sie dann die Ober- und Unterseite mit klarem Fingernagellack.
8. Sobald der Fingernagellack getrocknet ist, belichten Sie die Dias sofort oder lagern Sie sie in einer lichtdichten, dichten Diabox bei -20 °C.
9. Innerhalb einer Woche werden Gehirne mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit Anregungslasern und Filterwürfeln abgebildet, die für die ausgewählten fluoreszierenden Sekundärantikörper geeignet sind. Z-Stapel-Bilder von Pilzkörperneuronen werden typischerweise mit 20X- oder 40X-Objektiven aufgenommen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Montage von Gehirnen zur Vorbereitung der Immunfluoreszenzbildgebung. (A) Die Gehirne sind auf SuperFrost Plus-Rutschen mit einer Brückenabdeckung montiert, um eine Abflachung des Gehirns zu verhindern. Zwei "Basis"-Deckgläser werden mit klarem Fingernagellack auf einen positiv geladenen SuperFrost Plus-Objektträger geklebt und dazwischen werden präparierte Gehirne gelegt. Ein durchsi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikrodissektionszange/Pinzette	Ted Pella	505 Seemeilen
Sylgard Gerichte	Instrumentierung lebender Systeme	DD-50-S-BLK	Erhältlich ab amazon.com
Fas2 Antikörper	Entwicklungsstudien Hybridom-Bank	1D4
Chaoptin Antikörper	Entwicklungsstudien Hybridom-Bank	24B10
GFP Antikörper	Aves Lab	GFP-1010
Alexa488 Anti-Maus für Ziegen Sekundärer Antikörper	ThermoFisher	Nr. A-11001
Alexa488 Anti-Huhn für Ziegen Sekundärer Antikörper	ThermoFisher	Nr. A-11039
Alexa647 Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper	ThermoFisher	Nr. A-21236
20% Paraformaldehyd	Dienstleistungen für Elektronenmikroskope	RT15713
VectaShield	Vektor-Labore	H-1000
SuperFrost Plus Rutschen	ThermoFisher	Artikel-Nr.: 99-910-01
Deckgläser	ThermoFisher	Tel.: 12-553-454
Na Phosphatpuffer einbasisch	Sigma	Nr. S3139
Na Phosphat Puffer zweibasisch	Sigma	Nr. S3264
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
Fingernagellack	Dienstleistungen für Elektronenmikroskope (EMS)	Artikel-Nr.: 72180
stereomikroskop	Leica S6D mit KL300 LED-Lichtquelle
9-Well-Schale (Spotplatte)	VWR	Tel.: 89090-482
Nutator/Wippe	Fischer	22-363-152 oder 88-861-041
35mm Schüssel	Genesee Scientific	Nr. 32-103
Sylgard	Fischer	Tel.: 50-366-794
Kimwipe	Fischer	Tel. 06-666
Potentielle Fixierungspuffer
PTN-Puffer			0,1 M Naphosphat, pH 7,2, 0,1 % Triton-X-100, bilden typischerweise 0,5 l 0,1 M NaPhosphat-Puffer und aliraten je nach Bedarf 50 ml
Fly Stocks erhältlich bei Bloomington
EVAV (C155)-GAL4		BL458	Panneuronaler GAL4-Treiber
w*;;; Nr. OK107-GAL4		BL 854	GAL4-Treiber für alle Pilzkörperneuronen (OK107-GAL4-Insertion erfolgt auf dem 4. Chromosom)
y(1), w(67c23); c739-GAL4		BL 7362	GAL4-Treiber für Alpha- und Beta-Lappen (auf dem 2. Chromosom)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64305	GAL4-Treiber für Alpha- und Beta-Lappen, enthält auch UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4		BL 4440	GAL4-Treiber für hauptsächlich die Gamma-Lappen des Pilzkörpers (auf dem 2. Chromosom)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64296	GAL4-Treiber für Pilzkörper-Gamma-Lappen, enthält auch UAS-CD8-GFP