>1. Vorbereitung für die Mikroinjektion
- Bereiten Sie sich auf die Injektion vor, indem Sie Glaskapillaren mit einem Mikropipettenabzieher ziehen (siehe Materialtabelle) und befolgen Sie dabei das fünfstufige Protokoll für das Ziehen von Glaskapillarröhrchen (Tabelle 1).
- Öffnen Sie die Spitze der Nadel (dünnwandige Glaskapillaren [3,5 Zoll] mit Filament, Außendurchmesser [OD] 1,14 mm) mit einer Pinzette schräg auf die entsprechende Größe (Abbildung 1A).
- Füllen Sie die Nadel mit 0,1 mL Mineralöl, um sicherzustellen, dass keine Blasen entstehen.
- Entfernen Sie den Schraubverschluss der Stahlnadel des Mikroinjektionsgeräts. Richten Sie das Glasnadelloch an der Stahlnadel aus und ziehen Sie dann den Schraubverschluss fest. Montieren Sie die beladene Nadel-Mikroinjektionsvorrichtung in einem Mikromanipulator (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie die Position der Mikroinjektionsvorrichtung so ein, dass der Mikromanipulator die Vorrichtung unter dem Mikroskop flexibel bewegen kann. Geben Sie eine bestimmte Menge Paraffinöl ab, damit die Stahlnadel in das Kapillarglasrohr eindringt.
- Geben Sie die Injektionslösung (z. B. 1× phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder 5 mg/ml LPS) auf einen mit 70%igem Ethanol sterilisierten Objektträger und stellen Sie die Mikroinjektionsvorrichtung so ein, dass die Spitze in den Flüssigkeitstropfen eingeführt wird. Laden Sie ~2 μl Injektionslösung in die Nadel.
- Richten Sie den Mikromanipulator (Feineinstellung von oben, unten, links und rechts) so ein, dass sich die Nadelspitze des Mikroinjektionsgeräts im gleichen Sichtfeld befindet wie die Larven bei starker Vergrößerung (Abbildung 1B).
>2. Zebrafische für Mikroinjektionen montieren
HINWEIS: Die Entwicklung des Zebrafisch-Gehirns erfolgt innerhalb von 3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) und reift bei 5 dpf mit einem gut entwickelten Zentralnervensystem. Daher eignen sich 5-dpf-Larven bereits für die Untersuchung von LPS-vermittelten neuronalen Schäden sowie Verhaltens- und Entzündungsreaktionen.
- Injizieren Sie die Zebrafischlarven innerhalb von ca. 30 Minuten nach Erreichen des interessierenden Stadiums, um die Konsistenz des Injektionszeitpunkts zu wahren.
- Um die Zebrafischlarven zu betäuben, kombinieren Sie Tricain mit sauberem Aquarienwasser (Endkonzentration von 0,02 % w/v Tricain).
- Eine Lösung von 2%iger Agarose in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) in der Mikrowelle schmelzen. Gießen Sie die geschmolzene Agarose in eine Plastikschale. Die mit 2 % Agarose beschichtete Kunststoffschale kann bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- Verwenden Sie eine Transferpipette aus Kunststoff, um betäubte Larven in die Mitte der mit 2 % Agarose beschichteten Kunststoffschale zu transportieren. Richten Sie die montierten Larven mit der Gehirnseite nach oben aus, um den Zugang zur Nadel zu erhalten.
>3. Injektion des Hirnventrikels
- Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops so ein, dass die ventrikuläre Struktur des Gehirns des Zebrafisches im Sichtfeld deutlich dargestellt wird (Abbildung 1B).
- Platzieren Sie die Nadel vorsichtig über dem Hirntektum (Abbildung 1C).
- Durchstechen Sie die Haut des Zebrafischgehirns mit der Nadelspitze langsam mit dem Mikromanipulator.
- Drücken Sie das Fußpedal, um 1 nL 1x PBS oder unterschiedliche Konzentrationen von LPS (1,0, 2,5 und 5,0 mg/ml) auszustoßen (siehe Materialtabelle). Als Beispiel sind erfolgreiche Ventrikelinjektionsbilder dargestellt, bei denen der Hirnventrikel mit 1 nL 1% Evansblau-Farbstoff (in PBS verdünnt) injiziert wurde (Abbildung 1D). Übertragen Sie die Larven unmittelbar nach der Injektion in sauberes Eiwasser (E3). Nach 24 Stunden werden die Larven für die mikroskopische Bildgebung, den Bewegungsverhaltenstest und die Bestimmung anderer Indikatoren gesammelt.
