Modellierung des durch reaktive Sauerstoffspezies induzierten neuronalen Todes in zerebellären Körnerneuronen der Maus

>1. Experimentelle Vorbereitung

HINWEIS: Die folgenden Stammlösungen können bis zur Verwendung vorbereitet und gepflegt werden.

1. Lösung zum Sezieren
   1. Lösen Sie 3,62 g Natriumchlorid (NaCl), 0,2 g Kaliumchlorid (KCl), 0,069 g Natriumphosphat (NaH₂PO₄ ∙ H₂O) und 1,306 g D-(+)-Glucose in 500 mL destilliertem H₂O. Geben Sie dann 12,5 ml HEPES-Puffer, 450 μl Phenolrotlösung und 20 ml Rinderserumalbumin (BSA)-Fraktion V in die Lösung. Mit 1 N Natriumhydroxid (NaOH) auf pH 7,4 einstellen.
   2. Mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern. Diese Lösung bleibt bis zu einer Woche bis zu 10 Tagen stabil.
2. Trypsin
   1. Bereiten Sie eine Stammlösung in einer Konzentration von 25 g/l Trypsin in 0,9 % Natriumchlorid vor. Lagern Sie die Lösung bei -20 °C.
3. Trypsin-Hemmer
   1. Bereiten Sie eine Brühe mit einer Konzentration von 10 mg/ml vor, indem Sie 1 g Hühnereiweiß-Trypsin-Inhibitor in 100 ml 1 mM HCl auflösen. Lagern Sie diese Lösung bei -20 °C.
4. Desoxyribonuklease (DNase)
   1. 100 mg DNase 1 werden in 10 mL sterilem Wasser gelöst, um einen Stamm von 10 mg/mL zu erhalten. Lagern Sie die Lösung bei -20 °C.
5. MgSO₄
   1. 6,02 g Magnesiumsulfat (MgSO₄) werden zu 50 mL destilliertem Wasser (H₂O) gegeben, um eine 1 M Brühe zu erhalten. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.
6. CaCl₂
   1. 0,735 g Calciumchlorid (CaCl₂∙ 2H₂O) werden in 50 ml destilliertem H₂O bis zu einer Stammkonzentration von 100 mM gelöst. Lösung bei 4 °C lagern.
7. Kcl
   1. 3,7275 g KCl werden in 50 mL destilliertem H₂O auf eine Stammkonzentration von 1 M gelöst. Die Lösung wird bei 4 °C gelagert.
8. D-(+)-Glukose
   1. 1,802 g D-(+)-Glucose werden in 50 mL destilliertem H₂O auf eine Stammkonzentration von 100 mM gelöst. Lösung bei 4 °C lagern.
9. Zellkultur-Medien
   1. Bereiten Sie Zellkulturmedien wie folgt vor: 5 ml hitzeinaktiviertes dialysiertes fötales Rinderserum, 500 μl 200 mM L-Glutamin, 100 μl 50 mg/ml Gentamycin und 1 ml 1,0 M KCL sollten zu 45 ml filtersterilisiertem Eagle's minimal essential Medium (E-MEM) hinzugefügt werden, das mit 1,125 g/l D-Glukose ergänzt wird, um 50 ml Kleinhirn-Granula-Neuron (CGN)-Kulturmedien zu erzeugen. Medien bei 4 °C lagern.
10. Cytosin Beta-D-Arabino-Furanosid
    1. 48 mg Cytosin-Beta-D-Arabinofuranosid in 10 ml Wachstumsmedien auf eine Stammkonzentration von 20 mM auflösen. Lösung bei -20 °C lagern.
11. Poly-D-Lysin
    1. Um einen Poly-D-Lysin-Stamm von 2 mg/ml zu erzeugen, fügen Sie 10 ml steriles H₂O zu 20 mg Poly-D-Lysin hinzu. Stammpoly-D-Lysin sollte bei -80 °C in 100 μl Aliquoten gelagert werden.
       Anmerkung: Die folgenden Lösungen sollten vor der Dissektion hergestellt und bis zur Verwendung bei 4 °C gehalten werden.
12. MgSO₄ ergänzte Dissektionslösung
    1. 300 μl Stamm-MgSO₄ bis 250 ml Dissektionslösung zugeben.
13. Trypsin-Dissektionslösung
    1. 100 μl Stammtrypsin und 12 μl Stamm-MgSO₄ bis 10 ml Dissektionslösung zugeben.
14. Trypsin-Inhibitor-Lösung 1
    1. 164 μl Stammtrypsin-Inhibitor, 250 μl Stamm-DNase 1 und 12 μl Stamm-MgSO₄ bis 10 ml Dissektionslösung zugeben.
15. Trypsin-Inhibitor-Lösung 2
    1. 1040 μl Stammtrypsin-Inhibitor, 750 μl Stamm-DNase 1 und 12 μl Stamm-MgSO₄ bis 10 mL Dissektionslösung zugeben.
16. CaCl₂ ergänzte Dissektionslösung
    1. 10 μl Stamm CaCl₂ und 25 μl Stamm MgSO₄ bis 10 mL Dissektionslösung zugeben.
17. Mit Poly D-Lysin beschichtete Kulturschalen
    1. Zur Beschichtung von Kulturschalen werden 100 μl Stammpoly-D-Lysin in 40 ml sterilem H₂O verdünnt. Für 35-mm-Nunc-Kulturschalen werden 2 ml verdünnte Poly-D-Lysin-Lösung zugegeben. Für 4-Well-Platten geben Sie 300 μl verdünntes Poly-D-Lysin in jede Well.
    2. Lassen Sie das Poly-D-Lysin 1 h lang stehen, bevor Sie jede Vertiefung mit 4 ml oder 600 μl (für 35-mm-Kulturschalen bzw. 4-Well-Platten) sterilem H₂O aspirieren und waschen. Dann das H₂O ansaugen und das Geschirr 1 h an der Luft trocknen lassen.

>2. Extraktion und Isolierung des Kleinhirns

1. Enthaupte einen 6–7 Tage alten Mäusewelpen mit einer Enthauptungsschere. Führen Sie die Dissektion des Gehirns in einer sterilen Gewebekulturhaube durch.
2. Um das Gehirn zu entfernen, fassen Sie den Kopf mit einer Pinzette und schneiden Sie mit einer Mikrodissektionsschere durch die Haut in Richtung des vorderen Teils des Kopfes, wie in Abbildung 1 gezeigt. Schneiden Sie dann mit einer neuen Schere durch den Schädelknochen, um das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Entfernen Sie den Schädel, der das Gehirn bedeckt, mit einer Pinzette und kitzeln Sie das Gehirn mit einer Pinzette oder einem Spatel heraus.
   1. Schneiden Sie bei Bedarf den Sehnerv durch, um das Gehirn als Ganzes herauszuholen.
3. Legen Sie das Gehirn in die Sezierlösung, die mit MgSO₄ ergänzt wird. Halten Sie die Lösung und das Gehirn auf Eis.
4. Nach der Entnahme des Gehirns wird unter einem Präpariermikroskop das Kleinhirn aus dem Gehirn präpariert, während es sich noch in der mit MgSO₄ ergänzten Dissektionslösung befindet, und die Hirnhäute mit einer feinen Pinzette entfernt. Drehen Sie das Kleinhirn auf seine ventrale Seite und stellen Sie sicher, dass der Plexus choroideus entfernt wird.
5. Das Kleinhirn wird in eine 35-mm-Schale gegeben, die ~1 ml MgSO₄ ergänzte Dissektionslösung enthält.
6. Das Gewebe in kleine Stücke schneiden und in ein 50-ml-Röhrchen mit 30 ml MgSO₄ gepufferter Dissektionslösung geben.

>3. Isolierung und Kultivierung von zerebellären Granula-Neuronen der Maus

1. Das 50-ml-Röhrchen mit dem gehackten Hirngewebe wird 5 Minuten lang bei 644 x g und 4 °C zentrifugiert.
2. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml Trypsin-Dissektionslösung hinzu. Schütteln Sie dann das Röhrchen 15 Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit bei 37 °C.
3. Geben Sie 10 ml Trypsin-Inhibitor-Lösung 1 in das Röhrchen und schütteln Sie es 2 Minuten lang leicht.
4. Das Röhrchen 5 min bei 644 x g und 4 °C zentrifugieren.
5. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml Trypsin-Inhibitorlösung 2 hinzu und geben Sie sie dann in ein 15-ml-Röhrchen.
6. Zerreiben Sie das Gewebe im 15-ml-Röhrchen, bis die Lösung trüb wird. Dann 5 Minuten ruhen lassen.
7. Entfernen Sie den durchsichtigen Überstand und geben Sie den Überstand in ein neues Röhrchen mit 1 ml CaCl₂ supplementierter Dissektionslösung.
8. Geben Sie einen weiteren ml Trypsininhibitorlösung 2 auf den Boden des Röhrchens, das das Pellet aus Schritt 3.6 enthält. Nochmals trituieren und 5 min ruhen lassen. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie ihn in das Röhrchen, das den Überstand aus Schritt 3.7 enthält (das ist eine Wiederholung der Schritte 3.6-3.7). Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der größte Teil des Gewebes mechanisch dissoziiert ist.
9. Für jeden ml Überstand werden 0,3 ml CaCl₂ supplementierte Dissektionslösung zur Überstandssammlung hinzugefügt.
10. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens und zentrifugieren Sie dann 5 Minuten lang bei 644 x g.
11. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 10 ml frisches Medium zum Pellet und mischen Sie.
12. Die Zellen können dann gezählt und auf eine Konzentration von 1,5 x 10⁶ Zellen/ml verdünnt werden. Bitte beachten Sie, dass im Allgemeinen 10 Millionen Zellen von jedem präparierten Gehirn erwartet werden, abhängig von der Trypsinisierungszeit und der Effizienz der Dissektion. Plattenzellen auf zuvor hergestellten Poly-D-Lysin-Platten. Für 4-Well-Platten 0,5 ml plädieren, was 7,5 x 10⁵ Zellen pro Well ergibt. Für 35-mm-Schalen ist eine Platte von 4 ml zu verwenden, was 6 x 10⁶ Zellen pro Platte ergibt.
13. Nach 24 Stunden geben Sie Cytosin-β-Arabino-Furanosid (AraC) zu den Platten, um die Kontamination der Gliazellen zu reduzieren. Für jeden ml Medium werden 0,5 μl 20 mM AraC benötigt. Für das Hinzufügen von AraC ist kein Medienwechsel erforderlich. Wenn die Zellen 7-8 Tage lang aufbewahrt werden sollen, wiederholen Sie diese Behandlung an Tag 3.
14. Halten Sie die Kulturen in einem 5 %_{CO 2 -}Inkubator bei 37 °C und füttern Sie die Kulturen alle 2 Tage nach 5 Tagen mit 100 μl 100 mM Glukose, die der Kultur für jeweils 2 ml Medium zugesetzt werden. Ein kompletter Medienwechsel ist nicht erforderlich.

>4. Modellierung neuronaler Verletzungen

1. Um den ROS-induzierten Zelltod (oxidativer Stress) zu induzieren, behandeln Sie Neuronen mit 75-100 μM Wasserstoffperoxid (H₂O₂) und wechseln Sie nach 5-minütiger Exposition mit H₂O₂ auf konditionierte Medien aus parallelen Kulturen. Beachten Sie, dass aufgrund der Instabilität von H₂O₂ die Konzentration auf ein Niveau optimiert wird, das nach 24 Stunden Behandlung einen Zelltod von 50-70 % in Kultur induziert (Abbildung 2).

Abbildung 1: Entnahme des Maushirns und Dissektion des Kleinhirns. (A) Um das Gehirn einer 6-7 Tage alten Maus mit einer Pinzette zu extrahieren, fassen Sie den Kopf und schneiden Sie die Haut mit einer Mikrodissektionsschere entlang der gestrichelten Linien nach vorne. Achten Sie darauf, nur die Haut und das Bindegewebe zu schneiden, da ein zu tiefer Schnitt den Schädel durchstechen und das Gehirn schädigen kann. Diese drei Schnitte, gerade entlang der Mittellinie und zwei seitlich gekrümmt, ermöglichen es, die Haut nach hinten zu schieben und den Schädel freizulegen. Einmal freigelegt, kann der Schädel mit der Spitze der Schere durchdrungen und nach vorne geschnitten werden. Es muss sehr darauf geachtet werden, dass das Kleinhirn nicht beschädigt wird, um die Identifizierung und Entfernung der Hirnhäute zu erleichtern. Nach dem Schneiden kann eine Pinzette verwendet werden, um den Schädel zurückzuschälen und das Gehirn freizulegen, das dann mit einer Pinzette oder einem Spatel in eine kühle Sezierlösung herausgekitzelt werden kann. Um das Gehirn zu entfernen, muss möglicherweise der Sehnerv durchtrennt werden. (B) Nach der Entnahme aus dem Schädel sollten die Hirnhäute mit einer Pinzette mit feiner Spitze aus dem Kleinhirn entfernt werden. (C) Mit einer Pinzette mit feiner Spitze wird das Kleinhirn vom verbleibenden Gewebe präpariert und inspiziert, um eine vollständige Entfernung der Hirnhäute sicherzustellen.

Abbildung 2: Modellierung der neuronalen Schädigung in Kleinhirn-Körnerneuronen. Isolierte Kleinhirn von Mäusen an Tag 6-7 werden nach dem in Teil 3 beschriebenen Verfahren in einzelne Zellen dissoziiert. Nach der Dissoziation werden die Zellen gezählt und in einem Volumen von Kulturmedien resuspendiert, um 1,5 x 106 Zellen/ml zu erzeugen. Bei 35-mm-Schalen werden 4 ml plattiert, was 6 x 106 Zellen pro Platte ergibt. Für die Bildgebung von Objektträgern werden 0,5 ml plattiert, was 7,5 x 105 Zellen/Vertiefung ergibt. CGNs können dann mit Lentiviren transduziert oder mit Adenoviren infiziert werden. Die Verwendung von Adenoviren am Tag der Plattierung (0 Tage in vitro (DIV)) führt zu einer Transfektionseffizienz von mehr als 90 % und ermöglicht die Untersuchung neuronaler Schädigung durch oxidativen Stress und DNA-Schäden. Die Zugabe von 10 μM Camptothecin (CPT) induziert DNA-Schäden, während 75-100 μM Wasserstoffperoxid (H2O2) oxidativen Stress induziert. Die Konzentration von H2O2 muss optimiert werden, um nach 24 Stunden einen Zelltod von 50 % zu induzieren. Die Infektion mit Adenoviren bei 5 DIV führt zu einer geringeren Transduktionseffizienz von weniger als 10%. Bei 7 DIV, wenn NMDA-Rezeptoren in der Kultur angereichert sind, können Neuronen mit 100 μM NMDA und 10 μM Glycin behandelt werden, um Exzitotoxizität zu induzieren. Dies ist ideal für die anschließende bildgebende Analyse oder die Verfolgung eines einzelnen Neurons. Schließlich ergibt die Transduktion mit Lentiviren bei 0 DIV, gefolgt von der Behandlung mit 100 μM NMDA und 10 μM Glycin bei 7 DIV, eine ausreichend hohe Transduktionseffizienz (>80%), um eine biochemische Analyse der Kultur zu ermöglichen, einschließlich ChIP-Sequenzierung, Untersuchung der Proteinexpression und Durchführung von Lebend-/Tot-Assays.