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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Immunhistochemie
- Färbung von Thymidin-Analoga
- Platzieren Sie Gewebeschnitte in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) und montieren Sie 5-8 Schnitte auf einem positiv geladenen Objektträger, wobei die serielle Reihenfolge von anterior nach posterior und die gleiche Ausrichtung beibehalten wird. Lassen Sie die Gewebeschnitte trocknen, damit sie vollständig an den Objektträgern haften, und zeichnen Sie dann mit einem hydrophoben Stift oder PAP-Stift einen Rand.
- Permeabilisieren Sie Schnitte mit Permeabilisierungspuffer (0,5 % TBS (tris gepufferte Kochsalzlösung) -Triton) für 20-30 min. Anschließend die Abschnitte 2x mit TBS-Triton für je 5 min waschen.
HINWEIS: Die Permeabilisierung unterstützt die Penetration intrazellulärer Antikörper. Die Permeabilisierungszeit kann je nach Gewebedicke und Antikörpereffizienz angepasst werden. Alternativ kann man die Waschmittelkonzentration erhöhen, um die Permeabilisierungspotenz zu erhöhen. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, nicht zu lange zu permeabilisieren, da die Fragilität des Gewebes mit zunehmender Permeabilisierungszeit zunimmt.
- Bereiten Sie die Reaktionslösung Edu (5-Ethinyl-2'-desoxyuridin) gemäß Tabelle 1 vor. Die Endkonzentration von Alexa488-Azid beträgt 15 μM in 1 mL Edu-Reaktionslösung.
- Inkubieren Sie die Abschnitte in der Edu-Reaktionslösung für 30 min bis 1 h und waschen Sie sie dann 3x in TBS-Triton für jeweils 5 min. Decken Sie nach diesem Schritt Objektträger in Alufolie ab, um sie vor Licht zu schützen. Überprüfen Sie zu diesem Zeitpunkt mit einem Fluoreszenzmikroskop, ob die Edu-Reaktion funktioniert. Edu-markierte Zellen fluoreszieren unter einem Epifluoreszenzmikroskop.
- Protokoll für montierte Gewebeschnitte
- Blockgewebeschnitte, die auf einem Objektträger aus Schritt 1.1.4 montiert sind, verwenden Sie Blockpuffer, der bei denselben Tieren wie der Sekundärantikörper, z. B. Eselserum, aufgebracht wurde, für 30 min bis 1 h und waschen Sie dann 2x in TBS-Triton für jeweils 5 min.
- Bereiten Sie während des Blockierungsschritts eine primäre Antikörperlösung (d. h. Hühner-Anti-Nestin-Lösung) vor, indem Sie die Primärantikörper in einer Blockierungspufferlösung im Verhältnis 1:200 mischen. 250 μl pro Objektträger reichen aus, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig in Lösung eingetaucht ist.
- Inkubieren Sie Gewebeschnitte in einer primären Antikörperlösung über Nacht bei RT, nachdem Sie die Waschungen blockiert haben. Ändern Sie diesen Schritt je nach verwendetem Primärantikörper.
Anmerkung: Wenn Antikörper einen hohen Hintergrund oder eine unspezifische Bindung aufweisen, kann eine Inkubation bei 4 °C anstelle von RT (Raumtemperatur) die Ergebnisse verbessern. Antikörper mit schlechter Gewebepenetration können bei Bedarf 2 Tage lang inkubiert werden.
- Inkubieren Sie Gewebeschnitte 3x in TBS-Triton für 5 min, um überschüssigen Primärantikörper zu entfernen. Inkubieren Sie dann Gewebeschnitte in Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern (z. B. Alexa 647 Anti-Huhn bei 1:200), die in einer Blockierungspufferlösung für 2 Stunden bei RT hergestellt wurden.
- Inkubieren Sie Gewebeschnitte 3x in TBS-Triton für 5 min, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen, und tragen Sie 300 μM DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) Lösung bei 1:100 in PBS für 15 min bei RT auf.
- Inkubieren Sie Gewebeschnitte 3x in PBS für 5 Minuten, um überschüssiges DAPI zu entfernen, und entfernen Sie den Pap-Pen-Kreis mit einem Wattestäbchen oder einem sanften Tuch aus dem Gewebe. Lassen Sie die Abschnitte trocknen und bringen Sie dann Montagemedium und Deckglas an. Lassen Sie Eindeckmedien trocknen, bevor Sie Dias bebildern.
Tabelle 1: Lösungen für die Immunhistochemie
| Frostschutzmittel | Ethylenglykol 150 mL + Saccharose 150 g + Füllung auf 500 mL 0,1 M PB für 500 mL Lösung |
| Citrat-Puffer | 9 mL Zitronensäurestamm + 41 mL Trinatriumcitratpuffer + 450 mL ddH2O |
| Zitronensäure-Bestand | [0,1 M] Zitronensäure 21 g/1 L ddH2O |
| Trinatriumcitrat-Bestand | [0,1 M] Trinatriumcitrat 29,4 g/1 L ddH2O |
| Tris Gepufferte Kochsalzlösung -Triton (TBS -Triton) | 0,05 % 100-x Triton in TBS |
| Permeabilisierungs-Puffer | 0,5 % 100-x Triton in TBS |
| Blockieren des Puffers | 0,33 mL Eselserum in 10 mL TBS-Triton |
| Edu-Reaktionslösung | Stellen Sie eine CuSO4,5H 2O-Lösung her, indem Sie 1 mg CuSO4,5H 2O in eine 4-ml-Lösung von [0,1 M] Tris pH 8,5 hinzufügen. Geben Sie dann 1:40 einer 600 μM Alexa488-Azidlösung und 10 mg/ml L-Na+ Ascorbat in die CuSO4,5H 2O-Lösung, bevor Sie sie auf das Gewebe auftragen. |