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>1. Pflege von Mikroglia-Zellkulturen
- Warmes Zellkulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin/Neomycin (PSN) bis 37 °C.
- Gewinnung von gefrorenen BV2-Mikrogliazellen in der Passage 18 - 25 aus der Lagerung bei -80 °C. Schnelles Auftauen der Zellen in einem 37 °C heißen Wasserbad.
- Die Zellen werden vorsichtig in einen belüfteten 75-cm-Kolben mit 2 Kolben mit 10 ml Zellkulturmedium überführt.
- Der Kolben wird mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert. Das Medium wird nach 24 Stunden abgesaugt und durch frisches Medium ersetzt. Züchten Sie die Zellen bis zu einer Konfluenz von ca. 70 - 80%.
>2. Zellen zählen und plattieren
- In einem 37 °C warmen Wasserbad DMEM und 1x-Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung erwärmen.
- Aspirieren Sie Medien aus den Zellen und fügen Sie 500 μl Trypsin hinzu. Bei 37°C für 2 - 5 min inkubieren.
- Mit einem Schaber werden die Zellen aus dem Kolben entnommen und in 5 ml DMEM suspendiert. Geben Sie die Zellen dreimal durch ein 70-μm-Sieb in ein 50-ml-Röhrchen.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und säen Sie 8.000 Zellen/Well in einer schwarzwandigen, durchsichtigen Bodenplatte in einem Endvolumen von 200 μl DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PSN. Die Platte in 5 % CO2 bei 37 °C 24 Std. inkubieren.
- Entfernen Sie altes DMEM und ersetzen Sie es durch 200 μl erwärmtes DMEM, ergänzt mit 1 % PSN, um die Mikroglia im Serum auszuhungern. Die Platte in 5 % CO2 bei 37 °C 24 Std. inkubieren.
>3. Mikroglia aktivieren
- In getrennten Röhrchen verdünnen Sie Silbernanopartikel (AgNPs) (0,01, 0,05 oder 0,1 μg/ml) und Vehikel-/Neutralkontrolle (Natriumcitrat, 0,04 mM) in serumfreiem DMEM, das mit 1 % PSN auf die endgültigen Arbeitskonzentrationen ergänzt wurde.
- Entfernen Sie 100 μl Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch 100 μl der geeigneten Behandlungsverbindung.
- Die Platte in 5 % CO2 bei 37 °C 24 Std. inkubieren.
>4. Filtern von konditionierten Medien
- Aus jeder Vertiefung werden 200 μl Medienüberstand aufgefangen und in einen Filter (Molekulargewichtsgrenzwert von 10 kDa) mit Auffangröhrchen (1,5 bis 2 ml Fassungsvermögen) überführt.
- Bei 14.000 x g bei Raumtemperatur 15 min zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Durchfluss (Überstand mit Partikeln) und setzen Sie den Filter kopfüber in ein neues Auffangrohr ein.
- Zentrifugieren Sie bei 1.000 x g bei Raumtemperatur für 2 min.
Anmerkung: Das resultierende filtrierte Medium (mit sekretierten Zytokinen) wird sechsfach konzentriert.
- Bringen Sie das Volumen des Konzentrats auf 400 μl mit frischem DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PSN, und lagern Sie es auf Eis.
>5. Aufrechterhaltung hypothalamischer Zellkulturen
- Warmes DMEM-Zellkulturmedium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PSN auf 37 °C.
- Es wird ein gefrorener Bestand an Hypothalamuszellen (mHypo-A1/2) in der Passage 18 - 25 erhalten, die bei 80 °C gelagert werden. Die Zellen werden in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell aufgetaut.
- Die Zellen werden vorsichtig in einen belüfteten 75-cm-Kolben mit 2 Kolben mit 10 ml Zellkulturmedium überführt.
- Der Kolben wird mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert. Das Medium wird nach 24 Stunden abgesaugt und durch frisches Medium ersetzt. Züchten Sie die Zellen, bis sie ungefähr bei 70 - 80% Konfluenz sind.
>6. Bestimmung der Toxizität von Hypothalamuszellen
- DMEM und 1x-Trypsin-EDTA-Lösung in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
- Aspirieren Sie Medien aus Hypothalamuszellen und fügen Sie 500 μl Trypsin hinzu. Bei 37 °C 2 - 5 min inkubieren. Entfernen Sie die Zellen mit einem Schaber aus dem Kolben, wie oben in Schritt 2 beschrieben.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und einer Hypothalamusplatte mit 5.000 Zellen/Well in einer schwarzwandigen, durchsichtigen Bodenplatte in einem Endvolumen von 200 μl DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PSN, und inkubieren Sie sie über Nacht in 5 % CO2 bei 37 °C.
- Mit einer Mehrkanalpipette werden 100 μl Altmedien entnommen und 100 μl gefilterte konzentrierte konditionierte Medien bis zu einer Endkonzentration von 1x zugegeben.
- Die Platte in 5 % CO2 bei 37 °C 24 Std. inkubieren.
- 22 μl Reazurin-Reagenz zugeben und die Platte 20 Minuten lang in 5 % CO2 bei 37 °C inkubieren.
- Zeichnen Sie mit einem Multimode-Spektralphotometer die Fluoreszenz (560 nm EX/590 nm EM) auf, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen. Melden Sie die Ergebnisse als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU).