>1. Vorbereitung von Reagenzien und Ausrüstung
- Bereiten Sie 1x Dissektionspuffer vor (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure [HEPES]; pH 7,2).
- Bereiten Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor.
- Bereiten Sie 1x PBT mit 1x PBS mit 0,01 % Triton X-100 vor.
- Bereiten Sie Fruchtsaft-Agar-Platten vor.14 Mischen Sie kurz 30 g Agar in 700 mL H2O und stellen Sie den Autoklav auf. 0,5 g Methylparaben in 10 ml Ethanol auflösen und Lösung zu 300 ml Fruchtsaftkonzentrat (Traube oder Apfel) geben. Das Konzentrat wird in eine autoklavierte Agarlösung eingemischt und in die Deckel der 10 mm x 35 mm großen Petrischalen gegossen.
Anmerkung: Trauben-Agar-Power-Premix kann auch von verschiedenen Unternehmen bezogen werden (siehe Materialtabelle).
- Besorgen Sie sich eine Pinzette der Größe 5, mit der Sie die Larven mechanisch verletzen können.
- Verwenden Sie standardmäßige Drosophila CO2 -basierte Anästhesiegeräte.
>2. Auswahl von Drosophila-Larven
- Nehmen Sie ein Fläschchen oder eine Flasche Drosophila mit wandernden Larven des dritten Stadiums, die bei 25 °C kultiviert wurden.
- Wählen Sie zehn einzelne Larven des 2. oder 3. Stadiums nach Aussehen aus. Larven des dritten Stadiums können durch das Auftreten von vorderen verzweigten Spiracles identifiziert werden, während Larven des zweiten Stadiums kleiner sind und eher keulenartige vordere Spiracles aufweisen.
Anmerkung: Larvenstadien können auch durch das Timing identifiziert werden. Bei 25 °C erscheinen die Larven des zweiten Stadiums etwa 48 h nach dem Schlüpfen und die Larven des dritten Stadiums häuten sich etwa 24 h später. Wenn man an der Untersuchung der Neurodegeneration am NMJ interessiert ist, müssen die Larven des zweiten Stadiums verletzt werden.
>3. Vorbereitung von Drosophila-Larven auf mechanische Verletzungen
- Heben Sie einzelne Larven vorsichtig mit einer Pinzette oder einem Pinsel auf und achten Sie darauf, sie in keiner Weise zusammenzudrücken.
- Setzen Sie zehn Larven direkt in eine Glasschale mit kaltem 1X PBS oder Sezierpuffer, um Speisereste zu entfernen und die Beweglichkeit der Larven zu verlangsamen.
>4. Mechanische Schädigung und Behandlung von Drosophila-Larven
- Jede einzelne Larve wird auf ein CO2 -Betäubungsgerät gelegt.
- Rollen Sie jede Larve unter einem Präpariermikroskop vorsichtig auf ihre dorsale Seite, um die Segmentnerven durch die Kutikula sichtbar zu machen.
- Positionieren Sie die Pinzette der Größe 5 etwa 1/2 bis 2/3 entlang der Länge der Larve, beginnend an den Mundhaken. Nach der Positionierung wird etwa 1/3 der ventralen Kutikula mit einer Pinzette der Größe 5 eingeklemmt, die die Segmentnerven enthält.
- Um sicherzustellen, dass die Segmentnerven der Larven verletzt werden, wenden Sie genügend Kraft an, um die Segmentnerven zu zerquetschen, aber lassen Sie die Kutikula intakt. Um die richtige Kraftmenge zu bestimmen, zerquetschen Sie 10 Larven und stellen Sie sicher, dass die Sterblichkeitsrate nach 5 Stunden unter 50 % liegt.
- Nach der Verletzung werden die Larven vorsichtig auf eine Fruchtsaft-Agarplatte mit ca. 0,5 g Hefepaste umgefüllt. Platzieren Sie jede Larve so, dass ihr vorderes Ende auf der Hefepaste liegt, damit sie trotz gestörter Motilität weiter fressen kann.
Anmerkung: Um sicherzustellen, dass die segmentalen Nerven der Larven verletzt wurden, kann eine gestörte Beweglichkeit der Larven nach dem Transfer auf die Agarplatte beobachtet werden. Verletzte Larven sind hinter der Verletzungsstelle effektiv gelähmt, können aber immer noch ihre Maulhaken bewegen und fressen. Eine hohe Sterblichkeitsrate von Tieren nach Verletzungen ist üblich, daher ist es am besten, 20-50% mehr Tiere zu verletzen, als für einen Versuch erforderlich sind.
- Legen Sie Agarplatten mit Hefepaste und 10 verletzten Larven auf den Boden einer leeren Petrischale von 100 x 15 mm. Decken Sie diese Petriplatte, in der sich nun die verletzten Larven auf einer Agarplatte befinden, mit einem feuchten Papiertuch ab und achten Sie darauf, dass das Papiertuch die Larven oder die Agarplatten nicht berührt. Stellen Sie diese Petrischale in einen größeren luftdichten Behälter bei Raumtemperatur (RT).
- Entnahme von Larven zur Dissektion nach bestimmten Zeiträumen (6, 12 oder 24 Stunden) nach der Verletzung.
Anmerkung: Um die unmittelbaren Auswirkungen einer Verletzung auf das axonale Zytoskelett zu untersuchen, können Larven direkt nach der Verletzung präpariert werden. Um axonale Transportdefekte zu untersuchen, können die Larven ca. 6 h nach der Verletzung präpariert werden. Etwa 12 h nach der Verletzung kann eine Anhäufung von ubiquitinierten Proteinen beobachtet werden, und 24 h nach der Verletzung kann eine Degeneration der Motoneuronen am NMJ beobachtet werden.