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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. In-vivo-Permeabilitäts-Assay
- Vorbereitungen von Lösungen:
- Für Dextran-Stammlösungen lösen Sie 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 sowie 3 kDa Dextran Texas Red in 500 μl 0,9%iger Natriumchloridlösung (20 mg/ml).
- Für die Dextran-Arbeitslösung pipettieren Sie kurz vor der Injektion 55 μl 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 Stammlösung (20 mg/ml) auf ein Stück Siegelfolie und fügen Sie 55 μl 3 kDa Dextran Texas Red Stammlösung (20 mg/ml) hinzu. 100 μl mischen und in einer feinen Einwegspritze auffangen (Endkonzentration 2 mg/100 μl).
- Für die 10%ige Formaldehyd-Stammlösung (Paraformaldehyd oder PFA) werden 10 g extra reines PFA-Pulver, 100 ml PBS und 200 μl 1N Natriumhydroxid (NaOH) in einem sauberen Glasbecherglas kombiniert und unter Rühren mit einem Magnetrührer auf genau 56 °C erhitzt. 30 min bei 56 °C halten, bis sich das PFA vollständig aufgelöst hat. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen, den pH-Wert auf 7,4 einstellen und durch einen Papierfilter filtern. Bei -20 °C lagern. Die Stammlösung kann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS weiter verdünnt werden.
- Gesunde C57BL/6-Mäuse oder C57BL/6-Mäuse, die an experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis oder EAE leiden, werden kurzzeitig mit Isofluran betäubt (die Maus wird für ca. 1 min sediert). Verwenden Sie ein automatisiertes System (Mäuse werden in einer Induktionskammer 4,5 % Isofluran in Sauerstoff ausgesetzt und dann auf eine Gesichtsmaske mit 2,1 % Isofluran übertragen).
- Legen Sie die anästhesierte Maus in eine seitliche Position auf dem Tisch und injizieren Sie dann intravenös (z. B. retroorbital) 100 μl fluoreszierende Tracer in die Maus, bevor die Maus aufwacht.
- Entfernen Sie sofort die Gesichtsmaske und stellen Sie sicher, dass die Maus nach der kurzen Narkose vollständig wach und beweglich ist. Lassen Sie den Tracer 15 Minuten lang zirkulieren.