Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

Abstract

Quelle: Tsuruta, F., et al. Quantifizierung von Endosomen- und Lysosomenmotilitäten in kultivierten Neuronen unter Verwendung von Fluoreszenzsonden. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video zeigt, wie neuronale Vesikel mit spezifischen fluoreszierenden Proteinen markiert werden, um ihre Bewegung zu visualisieren. Zuerst wird ein Plasmid, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Transfektionsmittel inkubiert und dann in eine Kultur von Neuronen eingeführt. Anschließend werden Bilder der Neuronen aufgenommen und analysiert, um die Bewegung der Vesikel zu verfolgen.

Protocol

>1. Abbildung der Vesikelmotilität

1. Bereiten Sie die Plasmide vor, die jede Art von Vesikel markieren. Verwenden Sie beispielsweise EGFP-Rab5 für frühe Endosomen, EGFP-Rab7 für späte Endosomen, LAMP-EGFP für Lysosomen und EGFP-LC3 für Autophagosomen.
   Anmerkung: Diese Plasmide sind auf Anfrage bei tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp erhältlich. In der Regel können Neuronen innerhalb von 3 bis 5 Tagen in vitro (Division oder DIV) mit diesen Plasmiden unter Verwendung von Transfektionsreagenzien transfiziert werden.
2. Mischen Sie 4,0 μg Plasmide mit 200 μl serumfreiem Medium durch Pipettieren. Verdünnen Sie in einem separaten Röhrchen 8 μl Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) in 200 μl serumfreiem Medium. 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
3. Mischen Sie die Plasmidlösung und die Transfektions-Regent-Lösung in Schritt 1.2 durch Pipettieren. 20 min bei RT inkubieren.
4. Serumfreies Medium und 400 μl der Plasmidlösung aus Schritt 1.3 in jede beschichtete Glasbodenschale geben, die kortikale Neuronen und zerebrales kortikales Kulturmedium enthält. Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 °C in einem 5% CO₂ -Inkubator für 30 Minuten. Ersetzen Sie das Medium durch 2 ml zerebrales kortikales Kulturmedium. Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 °C in einem 5% CO₂ -Inkubator für 1-2 Tage.
   Anmerkung: Bereiten Sie ein zerebrales kortikales Kulturmedium vor, das aus Neuronen-Basalmedium besteht, das mit 1x B-27-Supplementen, 2 mM L-Glutamin und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin ergänzt wird.
5. Nach 1 - 2 Tagen Transfektion wählen Sie die transfizierten Zellen für die Bildaufnahme aus.
   Anmerkung: Frühgeborene Neuronen mit weniger als 7 DIV neigen dazu, eine dynamische Vesikelmotilität zu zeigen. Wählen Sie Neuronen aus, die die Fluoreszenzsonde mäßig exprimieren, da keine klaren Bilder erhalten werden können, wenn ein stark exprimierendes Neuron ausgewählt wird. Wählen Sie außerdem eine typische neuronale Form, wie z. B. pyramidale Neuronen mit langen Axonen und komplizierten Dendriten, um die Identifizierung des Axons und der Dendriten zu erleichtern (siehe Abbildung 1A).
6. Bildaufnahme mit einem Zeitraffer-Bildgebungssystem: Verwenden Sie für die Bildgebung ein Fluoreszenzmikroskop, das mit einer CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) mit 40X Plan Apo 0.95NA oder 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektiven ausgestattet ist. Kontrollieren Sie die Temperatur auf 37 °C mit einem Inkubationssystem. Erfassen Sie Neuronenbilder mit einem Bild/5 s über einen Zeitraum von 100 s, gesteuert von der Bilderfassungssoftware. Alternativ können Sie Bilder in kürzeren Intervallen und über längere Zeiträume aufnehmen, z. B. mit einem Bild pro 2 s über einen Zeitraum von 300 s.
   Anmerkung: Für die Aufnahme sequenzieller Bilder gibt es eine Vielzahl von Anwendungen, von denen viele für diese Methode geeignet wären. Daher wird keine bestimmte Anwendung empfohlen; Stattdessen sollte jeder Forscher die verfügbare Anwendung verwenden.

>2. Bildanalyse

1. Öffnen Sie alle sequenziellen Bilder in der ImageJ-Software mit manueller Nachverfolgung.
   Anmerkung: Bisher wurde das manuelle Tracking in großem Umfang in Tracking-Experimenten eingesetzt. Das manuelle Tracking wurde von Dr. Fabrice Cordelières entwickelt. Eine detaillierte schriftliche Anleitung ist online verfügbar. Für die Analyse wird die Qualität der Bilddaten mit einer ausreichenden Anzahl von Bildern verbessert. Es wird empfohlen, mehr als 20 Bilder zu verwenden.
2. Um die sequenziellen Bilder zu kombinieren, wählen Sie→ → . Klicken.
3. Wählen Sie → ; es öffnet sich ein Tracking-Fenster.
4. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen von und definieren Sie die Tracking-Parameter im Abschnitt Parameter.
   Anmerkung: Es können mehrere Parameter eingestellt werden, darunter Zeitintervall, x/y-Kalibrierung, Z-Kalibrierung, Quadratgröße für die Zentrierung, Punktgröße, Linienbreite und Schriftgröße. In diesem vereinfachten Assay wurden sowohl das Zeitintervall als auch die x/y-Kalibrierung definiert. Unter anderen experimentellen Umständen kann es notwendig sein, auch andere Parameter zu definieren. Die hier verwendeten Parameter sind wie folgt: Der beträgt 5 s und der beträgt entweder 0,26642 μm für ein 40X Plan Apo 0,95NA Objektiv oder 0,10657 μm für ein 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektiv.
5. Nachdem die Parameter definiert sind, klicken Sie auf, um eine neue Spur zu starten.
6. Nachdem Sie die interessierenden Vesikel bestimmt haben (z. B. die Vesikel, die in Abbildung 1A (rechtes Bild) durch blaue und rote Pfeilspitzen gekennzeichnet sind), klicken Sie auf die Mitte der Signale in den sequenziellen Bildern, um die xy-Koordinaten aufzuzeichnen. Die Ergebnisse der aufgezeichneten XY-Koordinaten, der Entfernung und der Geschwindigkeit werden in einem neuen Fenster angezeigt.
   Anmerkung: Im Fall von Lysosomen werden häufig große helle Fluoreszenzsignale (z. B. Abbildung 1A (rechtes Bild), orangefarbene Pfeilspitze) in Neuronen beobachtet. Diese Signale weisen gelegentlich entweder akkumulierte Vesikel oder pathologische Krampfadern auf, so dass diese Signale zur Quantifizierung der Motilität vermieden werden sollten.
7. Wiederholen Sie Schritt 2.6, um die XY-Koordinaten der Vesikel aus allen sequenziellen Bildern zu erfassen. Nachdem der Referenzpunkt ausgewählt wurde, wechselt jedes Bild automatisch zum nachfolgenden Bild.
8. Exportieren Sie diese Daten in eine neue Tabelle (z. B. eine Tabelle). Verwenden Sie eine geeignete Software, um ein geeignetes Diagramm zu erstellen (siehe Materialtabelle).
   Anmerkung: Um die Daten zu analysieren, wählen Sie die Spalte aus, summieren Sie alle Werte dieser Spalte, und zeigen Sie einen Motilitätsabstand als Balkendiagramm an, z. B. in Abbildung 1B. Wiederholen Sie außerdem diesen Schritt, berechnen Sie den Durchschnitt des gesamten Motilitätsabstands, und zeigen Sie ihn als Balkendiagramm an, wie in Abbildung 1C. Die Software zum Erstellen eines Balkendiagramms und von Wellenformdaten wird in der Materialtabelle angezeigt.

Results

Abbildung 1: Lysosomenmotilität in neuronalen Dendriten. (A) Kortikale Neuronen der Maus (4 DIV) wurden 2 Tage lang mit LAMP-EGFP-Plasmid transfiziert. Dieses Bild zeigt die Motilität von LAMP-EGFP-haltigen Vesikeln in den Dendriten. Der Einschub zeigt das Zeitrafferbild der LAMP-EGFP-positiven Vesikel. Die rote Pfeilspitze zeigt ein sich bewegendes Bläschen an, und die blaue Pfeilspitze zeigt ein...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasales Medium	Thermo Fischer	Artikel-Nr.: 21103-049
Opti-MEM	Thermo Fischer	31985070	Serum freies Medium
Penicilin Streptmykin	Thermo Fischer	15140122
L-Glutamin	Thermo Fischer	25030081
B-27 Ergänzungen	Thermo Fischer	17504044
Poly-D-Lysinhydrobromid	Sigma	Nr. 7280
Poly-L-Ornithin	Sigma	Nr. P4957
Lipofectamin 2000	Thermo Fischer	11668027	Transfektionsreagenz
Polyethylenimin "Max"	Polywissenschaften	Artikel-Nr.: 24765	Transfektionsreagenz. Als Alternative zu Lipofectamine2000 stehen 0,1 mg/ml Polyethylenimin in sterilisiertem Wasser gelöst. Aber es ist ein geringer Wirkungsgrad und eine hohe Toxizität.
BIOREVO BZ-9000	Keyence	Na
Inkubationssystem INUG2-K13	Tokajer Treffer	Na
GraphPad Prism Version 6.0	GraphPad-Software	Na
Excel-Version 15	Microsoft	Na
ImageJ Version 1.47	Na	Na