Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Immunfluoreszenz
- Bereiten Sie Lösungen vor, einschließlich des Blockierungspuffers, des Antikörperpuffers, des Waschpuffers 1 und des Waschpuffers 2 (siehe Tabelle 1).
- Spülen Sie die Scheiben einmal mit Phosphatpuffer (PB) ab, um überschüssige Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) zu entfernen.
- Entferne die Lösung mit einer Plastikpipette, ohne die Hirnschnitte einzusaugen. Fügen Sie 250 μl frisches PB mit einer 1000 μl Pipette hinzu.
Vorsicht: Die Scheiben sollten nicht austrocknen, also die Flüssigkeit nach und nach herausnehmen und hinzufügen.
- Entfernen Sie das PB mit einer Kunststoffpipette und fügen Sie 250 μl Blockierungspuffer pro Vertiefung mit einer 1000-μl-Pipette hinzu. 3 h bei Raumtemperatur (RT) auf dem Schüttler inkubieren.
- Während der Inkubationszeit verdünnen Sie die Primärantikörper in Antikörperpuffer in einem Reaktionsröhrchen. Verwenden Sie 250 μl Antikörperpuffer pro Vertiefung und fügen Sie die entsprechende Menge Antikörper hinzu (siehe Tabelle 2), indem Sie ihn mit einer 2 μl Pipette direkt in die Lösung pipettieren. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Kurz danach vortexen, um eine gute Durchmischung zu gewährleisten.
Anmerkung: Zur Bestimmung der Hintergrundfluoreszenz sollte die Färbung auch ohne Zugabe des Primärantikörpers erfolgen. Inkubieren Sie dazu die Scheibe in Antikörperlösung ohne Primärantikörper gemäß dem Protokoll.
- Entfernen Sie nach der Inkubationszeit den Blockierungspuffer mit einer Kunststoffpipette und fügen Sie 250 μl Antikörperlösung mit Primärantikörpern pro Vertiefung hinzu. Die Scheiben mit dem Primärantikörper über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker inkubieren.
- Am nächsten Tag die Scheiben mit Waschpuffer 1 3x für 10 min bei RT auf einem Shaker waschen.
- Entfernen Sie das Medium mit einer Kunststoffpipette und fügen Sie 300 μl Waschpuffer 1 pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT. 3 Mal wiederholen.
- Während der Waschschritte verdünnen Sie die Fluorophor-gekoppelten Sekundärantikörper in Antikörperpuffer in einem Reaktionsröhrchen. Verwenden Sie 250 μl Antikörperpuffer pro Vertiefung und fügen Sie die entsprechende Menge Antikörper hinzu (siehe Tabelle 2), indem Sie ihn mit einer 2 μl Pipette direkt in die Lösung pipettieren. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Kurz danach vortexen, um eine gute Durchmischung zu gewährleisten.
Vorsicht: Da die Antikörper lichtempfindlich sind, müssen alle Schritte ab diesem Zeitpunkt im Dunkeln durchgeführt werden.
- Entfernen Sie nach den Waschschritten den Waschpuffer mit einer Kunststoffpipette und fügen Sie pro Vertiefung 250 μl Antikörperlösung mit Sekundärantikörpern hinzu. Inkubieren Sie die Scheiben mit Sekundärantikörper für 90 min bei RT im Dunkeln.
- Die Scheiben mit Waschpuffer 2 3x 10 min bei RT waschen.
- Während der Waschschritte wird 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 0,1 M PB in einer Konzentration von 1:2000 verdünnt.
- Entfernen Sie den Waschpuffer 2 mit einer Kunststoffpipette und fügen Sie 250 μl DAPI-Lösung pro Vertiefung hinzu. 5 min bei RT auf dem Shaker inkubieren.
- Entfernen Sie die DAPI-Lösung mit einer Kunststoffpipette und fügen Sie mit einer 1000-μl-Pipette 500 μl 0,1 M PB pro Vertiefung hinzu.
- Montieren Sie Scheiben auf Objektträger.
- Legen Sie einen Objektträger unter das Stereoskop. Geben Sie mit einem feinen Pinsel drei separate Tropfen 0,1 M PB auf den Objektträger. Legen Sie eine Scheibe pro Tropfen auf den Objektträger.
- Verwenden Sie den feinen Pinsel, um die Scheiben auf dem Objektträger zu glätten und auszurichten.
- Wenn alle Scheiben richtig positioniert sind, entfernen Sie überschüssiges PB mit einem Taschentuch und trocknen Sie den Objektträger vorsichtig ab.
Vorsicht: Vermeiden Sie es, die Gehirnscheiben vollständig zu trocknen.
- Geben Sie 80 μl Einbettungsmedium auf den Objektträger. Senken Sie das Deckglas vorsichtig auf den Objektträger ab und betten Sie so die Hirnschnitte ein.
- Lassen Sie die Objektträger 1-2 h im Abzug trocknen (decken Sie sie ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden) und lagern Sie sie in einer Objektträgerbox bei 4 °C.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
>2. Bildgebung
- Nachdem das Einbettmedium vollständig ausgehärtet ist, legen Sie den Objektträger unter das Konfokalmikroskop.
Anmerkung: Die Epifluoreszenzmikroskopie in Kombination mit einer Dekonvolutionssoftware sollte eine ähnliche Bildqualität liefern.
- Passen Sie die Lasereinstellungen an, indem Sie die Laserintensität für jeden Kanal erhöhen oder verringern, so dass nur wenige Pixel überbelichtet werden, um eine maximale Verteilung der Grauwerte zu gewährleisten.
- Erfassen Sie virtuelles Gewebe des gesamten Gehirnschnitts für die verschiedenen Kanäle.
- Wählen Sie in der Bildgebungssoftware die Option Kacheln und grenzen Sie den Gehirnschnitt manuell mit der Kachelregion einrichten ab.
- Verteilen Sie Stützpunkte im gesamten Kachelbereich und passen Sie den Fokus für die verschiedenen Stützpunkte an, indem Sie auf Kachelregionen/-positionen überprüfen drücken.
- Passen Sie die Einstellungen im Aufnahmemodus entsprechend der gewünschten Auflösung und Dateigröße des resultierenden Bildes an und starten Sie den Scan.
- Wenn der Scan abgeschlossen ist, verwenden Sie die Stitching-Funktion, um das virtuelle Gewebe zu bearbeiten. Exportieren Sie die Datei als .tif mit der Funktion Bildexport.
>3. Computergestützte Analyse
- Laden Sie alle einzelnen Kanäle für ein Bild in FIJI, indem Sie auf Datei| Öffnen.
- Markieren Sie mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug eine Hemisphäre im DAPI-Kanal. Erstellen Sie eine Maske der Auswahl, indem Sie auf Bearbeiten| Auswahl| Maske erstellen.
- Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle (Mover und Synaptophysin), indem Sie auf Analysieren| Messen.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass Sie die verschiedenen Kanäle auswählen, um die mittleren Fluoreszenzintensitätswerte für jeden Kanal zu bestimmen.
- Kopieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in eine Tabelle.
- Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in einem interessierenden Bereich, indem Sie den Bereich auch mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug abgrenzen. Verwenden Sie einen Mausgehirnatlas als Referenz.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.5 für alle Hemisphären und alle interessierenden Bereiche.
Anmerkung: Ermitteln Sie die Werte für jede Hemisphäre separat, um später die Werte in einem interessierenden Bereich mit dem in der Hemisphäre vergleichen zu können (siehe Schritt 4.2).
>4. Umgang mit Daten
- Falls die Hintergrundfluoreszenz hoch ist, kann eine Hintergrundsubtraktion erforderlich sein. Bestimmen Sie dazu die mittlere Fluoreszenzintensität für die Schnitte, die ohne primären Antikörper gegen das Referenzprotein (hier: Synaptophysin) verarbeitet wurde, und subtrahieren Sie diesen Wert von allen Werten, die für die Hirnregionen und Hemisphären erhalten wurden.
- Wenn die mittleren Fluoreszenzintensitäten für die einzelnen Kanäle für jede Hemisphäre und jeden interessierenden Bereich bestimmt wurden (siehe Tabelle 3), berechnen Sie das Verhältnis von Mover zu Synaptophysin, indem Sie den Wert für Mover durch den Wert für Synaptophysin dividieren (gelb in Tabelle 3). Führen Sie diese Aktion für jede Hemisphäre und jeden Interessenbereich separat aus.
- Teilen Sie das für einen interessierenden Bereich erhaltene Verhältnis durch das für die entsprechende Hemisphäre erhaltene Verhältnis (orange in Tabelle 3), um das Verhältnis des interessierenden Bereichs zur Hemisphäre zu bestimmen.
- Um die relative Bewegerhäufigkeit zu bestimmen, übersetzen Sie das in 4,2 erhaltene Verhältnis in einen Prozentsatz, indem Sie seine Abweichung von 1 bestimmen (rot in Tabelle 3). Ein Verhältnis von 1,25 würde daher eine relative Mover-Abundanz von 25 % über dem Durchschnitt ergeben, und ein Verhältnis von 0,75 würde eine relative Mover-Abundanz von 25 % unter dem Durchschnitt ergeben.
Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete Lösungen.
| Fixiermittel (500mL) |
Mix 20g Paraformaldehyd (Gesamtkonz.: 4%)
50 mL 10x PBS Stammlösung (Gesamtkonk.: 1x)
450 mL biest H2OAdjust pH bis 7,4 mit NaOH
Hinweis: Um das Paraformaldehyd in PBS zu lösen, erhitzen Sie die Lösung. Nicht über 70 °C erhitzen, da PFA bei Temperaturen über 70 °C zerfällt.
Achtung: PFA ist giftig, potenziell krebserregend und teratogen. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit PFA arbeiten, und arbeiten Sie unter dem Abzug. Vermeiden Sie die Verschluckung. |
| 0.1M PB (1L) |
Stammlösung X
35.61 g Na2HPO4.2H 2O in 1 L bidest H2O | Stammlösung Y
27.60 g NaH2PO4.2H 2O in 1 L bidest H2O |
Mischung 385 mL Stammlösung X
115 mL Stammlösung Y
500 mL bidest H2O |
| Blockierender Puffer (50 ml) |
Mischen Sie 1,25 mL normales Ziegenserum (Gesamtkonz.: 2,5%)
1,25 mL normales Eselserum (Gesamtkonz.: 2,5%)
0,5 mL nichtionisches Tensid (Triton-X100, Gesamtkonz.: 1%)
47 mL 0,1 M PB |
| Antikörper-Puffer (50 mL) |
Mischen Sie 0,25 mL normales Ziegenserum (Gesamtkonz.: 0,5%)
0,25 mL normales Eselsserum (Gesamtkonz.: 0,5%)
0,1 mL nichtionisches Tensid (Gesamtkonz.: 0,2 %)
49,4 mL 0,1 M PB |
| Waschpuffer 1 (50 mL) |
Mischen Sie 1 mL normales Ziegenserum (Gesamtkonz.: 2 %)
49 mL 0,1 M PB |
| Waschpuffer 2 (50 mL) |
Mischen Sie 0,5 mL normales Ziegenserum (Gesamtkonz.: 1 %)
49,5 mL 0,1 M PB |
Tabelle 2: In diesem Protokoll verwendete Antikörper.
| Primäre Antikörper |
| Gerichtet gegen | Wirtsarten | RRID | Konzentration |
| beweger | Kaninchen | AB_10804285 | 1:1000 |
| Synaptophysin | Meerschweinchen | AB_1210382 | 1:1000 |
| Sekundäre Antikörper |
| Zielarten | Wirtsarten | Fluorophor | Konzentration |
| Kaninchen | Esel | AlexaFluor 647 | 1:1000 |
| Meerschweinchen | Ziege | AlexaFluor 488 | 1:1000 |
Tabelle 3: Beispiel für die Datenverarbeitung.
kg
kg
kg
kg
| Hemisphäre |
| Hemisphäre # | Mittlere Fluoreszenzintensität Synaptophysin (A.U.) | Mittlere Fluoreszenzintensität Mover (A.U.) | Ratio-Beweger/Synaptophysin | | |
1
2
3
4
5
6 | 29.134
31.008
38.641
30.775
21.658
27.277 | 22.810
24.046
29.324
25.444
18.091
23.364 | =C3/B3 0,783
=C4/B4 0,775
=C5/B5 0,759
=C6/B6 0,827
=C7/B7 0,835
=C8/B8 0,857 | | |
| Hippocampus |
| Hemisphäre # | Mittlere Fluoreszenzintensität Synaptophysin (A.U.) | Mittlere Fluoreszenzintensität Mover (A.U.) | Ratio-Beweger/Synaptophysin | Verhältnis zur Hemisphäre | Relative Bewegerhäufigkeit (%) |
1
2
3
4
5
6 | 35.26
33.955
41.231
39.853
30.129
28.737 | 29.889
27.825
31.978
31.787
27.817
25.861 | =C11/B11 0,848
=C12/B12 0,819
=C13/B13 0,776
=C14/B14 0,798
=C15/B15 0,923
=C16/B16 0,900 | =D11/D3 1,083
=D12/D4 1,057
=D13/D5 1,022
=D14/D6 0,965
=D15/D7 1,105
=D16/D8 1,051 | =(E11-1)*100 8,269
=(E12-1)*100 5,673
=(E13-1)*100 2.200
=(E14-1)*100 -3,528
=(E15-1)*100 10.530
=(E16-1)*100 5,064 |
