Beurteilung der strukturellen Integrität der neuromuskulären Verbindungen des dorsalen Längsmuskels bei Drosophila

>1. Schockfrosten und Thoraxbisektion

1. Bevor Sie mit den Bisektionen beginnen, füllen Sie einen Dewargefäß mit flüssigem Stickstoff und tragen Sie geeignete Kryoschutzhandschuhe und eine Schutzbrille. Besorge dir einen Klingenbrecher, Federklingen, eine feine Pinzette, Eis, eiskalte 1x PBS und eine kryogene Pinzette.
2. Bereiten Sie einen Eiskübel vor, um 1x PBS eiskalt zu halten.
3. Greife mit dem Klingenbrecher die Federklinge schräg und biege die Klinge, um ein kleines Stück abzubrechen. Der Klingenbrecher kann die Klinge dann in Position halten, um sie als kleines Skalpell zu verwenden.
   Anmerkung: Eine Klinge sollte für alle Gruppen ausreichen. Schalten Sie um, wenn die Klinge bricht oder stumpf wird.
4. Setzen Sie eine saubere Pipettenspitze in den P200 ein und entfernen Sie 1/5 der Spitze, um Proben zu transportieren.
5. Bereiten Sie für jede Gruppe ein neues Mikrozentrifugenröhrchen vor und geben Sie 200 μl 1x PBS in jedes Röhrchen. Dieses zweite Röhrchen wird verwendet, um die letzten DLM-Vorbereitungen zu sammeln.
6. Entfernen Sie alle 1x PBS mit einer Pasteurpipette aus den Röhrchen.
7. Tauchen Sie das Röhrchen mit der kryogenen Pinzette mit geeigneter Schutzausrüstung 10 s lang in den Flüssigstickstoffkolben.
   Anmerkung: Die Rohre sollten fest verschlossen werden, damit das Rohr nicht explodiert.
8. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem flüssigen Stickstoff und geben Sie mit einer Pasteur-Pipette ca. 300 μl eiskaltes 1x PBS zu den Proben. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
9. Geben Sie eiskaltes 1x PBS in die 10 cm Präparierschale, die mit Silikonelastomer beschichtet ist, und geben Sie den ersten Thorax mit der modifizierten 200 μL-Pipette ab.
10. Platzieren Sie den Thorax mit der Bauchseite nach oben. Verwenden Sie in der einen Hand eine stumpfe Pinzette, um den Thorax zu positionieren, und in der anderen Hand verwenden Sie eine feine Pinzette, um einen Teil des Thoraxganglions zu entfernen, um die Mittellinie des Thorax freizulegen.
11. Verwenden Sie die Mittellinie des Brustkorbs als Führung, um mit der Klinge einen flachen Schnitt durch 1/3 des Brustkorbs zu machen.
12. Entfernen Sie die Klinge vom Thorax und positionieren Sie den Thorax mit der stumpfen Pinzette in einem 45°-Winkel. Setzen Sie die Klinge wieder ein und schneiden Sie gerade an der Mittellinie des Brustkorbs entlang. Daraus ergeben sich zwei Hemithoraces.
13. Nehmen Sie jeweils einen Hemithorax und entfernen Sie das überschüssige Gewebe unter der DLM-Muskelfaser F (Abbildung 1B), der ventralsten Faser. Machen Sie mit der Klinge vorsichtig ein oder zwei Schnitte, um das überschüssige Gewebe zu entfernen, ohne die DLMs zu beschädigen.
14. Nach der Isolierung wird der Hemithorax mit 1x PBS in das richtige Röhrchen überführt.
15. Wiederholen Sie die Schritte 1.6 bis 14, bis 10 präparierte Hemithoraces pro Gruppe gemacht sind.

>2. Strukturelle Färbung

1. Nach der Halbierung der Thoraxproben legen Sie das Gewebe in einen Blockierungspuffer (1x PBS mit 0,1 % normalem Ziegenserum und 0,2 % Triton X-100 bei pH 7,4), um das Gewebe zu permeabilisieren und unspezifische Verfärbungen zu verhindern. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um überschüssiges 1x PBS zu entfernen, und geben Sie 1,5 ml Blockierungspuffer in jedes Röhrchen. Blockieren Sie das Gewebe für mindestens 1 h bei 4 °C.
2. Bereiten Sie die Proben für die strukturelle Färbung mit einem fluoreszierend konjugierten Antikörper, Meerrettichperoxidase 488 (anti-HRP-488) in einer Verdünnung von 1:200 und Phalloidin-647 in einer Verdünnung von 1:1000 in Blockpuffer vor, um Motoneuronen bzw. Muskelgewebe zu färben. Machen Sie genug Fleck, um 150 μl pro Tube zu haben. Lagern Sie den Fleck bei 4 °C in Folie abgedeckt oder in einer dunklen Box, bis er zum Färben bereit ist.
3. Entfernen Sie nach dem Blockieren den überschüssigen Blockierungspuffer mit einer Pasteurpipette aus Glas.
4. Bevor Sie den strukturellen Fleck auftragen, wirbeln Sie den Fleck ein. Geben Sie 150 μl des Flecks in jedes Röhrchen. Die Proben werden in einer dunklen Box bei Raumtemperatur für 2 Stunden auf den Rotator gelegt.
5. Entfernen Sie den Fleck und waschen Sie das Taschentuch viermal in 1,5 ml Raumtemperatur 1x PBS mit 0,3 % Triton X-100 für 5 Minuten auf dem Rotator in einer dunklen Box. Die Muster können nun auf einen Objektträger montiert werden.

>3. Montieren von Gewebe

1. Bereiten Sie nach dem Waschen der Proben in PBST einen Objektträger vor, um Gewebe für die Färbung zu montieren. Bereiten Sie zusätzliches Material vor, darunter Glasabdeckfolien, eine P200-Pipette, 200-μl-Pipettenspitzen, eine Schere, durchsichtige Verstärkungen, eine Pinzette mit gerader Kante, lichtbeständige fluoreszierende Eindeckmedien, Nagellack und eine dunkle Box zum Abdecken der Objektträger.
2. Beschriften Sie den Objektträger, um die Proben zu identifizieren, und reinigen Sie ihn mit Kim-Tüchern, um Flecken zu entfernen.
3. Um sicherzustellen, dass das Deckglas die Hemithorax-Proben nicht beschädigt, bauen Sie eine "Brücke" mit Verstärkungsetiketten. Schneiden Sie ein Verstärkungsetikett in zwei Hälften und platzieren Sie jede Hälfte im Abstand von ca. 15 mm. Dieser Abstand muss kleiner sein als die Breite des Deckglases. Wiederholen Sie diesen Schritt viermal, um eine "Brücke" zu vervollständigen, die 5 Beschriftungen hoch ist.
4. Nehmen Sie die P200-Pipette und modifizieren Sie eine Spitze, indem Sie 1/5 der Spitze abschneiden, um die Proben auf den Objektträger zu übertragen. Die Proben sollten auf den Objektträger in der Mitte des Stegs übertragen werden.
5. Nehmen Sie den Rand eines Labortuchs und entfernen Sie überschüssiges PBST. Ordnen Sie die DLMs mit einer Pinzette so an, dass alle Proben mit der Muskelseite nach oben und mit der Nagelhautseite nach unten zeigen.
6. Tragen Sie mit einer Standard-Pipettenspitze P200 70 μl Einbettmedium auf den Objektträger auf, um Luftblasen zu vermeiden. Dosieren Sie das Medium in einem kreisförmigen Muster innerhalb der Verstärkungen, beginnend von außen in die Mitte.
7. Legen Sie einen Deckschirm über die Verstärkungen.
8. Verwenden Sie Nagellack, um die Außenkanten um den Umfang des Deckglases herum zu beschichten. Großzügig auftragen, um eine vollständige Versiegelung des Gewebes zu bilden.
9. Legen Sie den Objektträger im Dunkeln auf eine ebene Fläche und lassen Sie ihn mindestens 10 Minuten trocknen, um Photobleiche oder Fluoreszenzverlust zu vermeiden. Objektträger können nun sofort für die Bildgebung verwendet oder anderweitig in einem Objektträgerordner bei -20 °C für die spätere Betrachtung aufbewahrt werden.

Abbildung 1: Progressive Denervierung von DLM-Synapsen in einem Drosophila-Modell der ALS. (A) Die Erzeugung von ALS-transgenen Fliegen, die eine humane mutierte Form des Tar-Binding Proteins von 43 kDa (TDP-43) exprimieren, ist im Schema dargestellt. (B) Die Abbildung zeigt die Form und Ausrichtung eines Hemithorax bei einer adulten Drosophila. Mit Hilfe des Protokolls können wir den fortschreitenden Verlust der synaptischen Integrität von DLM-NMJ-Synapsen durch strukturelle Färbung von Motoneuronen mit HRP (grün) und Muskelgewebe mit Phalloidin (magenta) beobachten. Unser Modell zeigt den Verlust der synaptischen Integrität in einem adulten ALS-Modell durch die Erzeugung adulter Fliegen, die eine Mutante von humanem TDP-43M337V in Motoneuronen exprimieren (Abbildung 1F\u2012H) im Vergleich zu WT (Abbildung 1C\u2012E) Fliegen in der Muskelfaser C. Pfeile zeigen Beispiele für eine WT-Synapse (Abbildung 1C) und ein Beispiel für den Verlust der synaptischen Integrität. Maßstabsleiste = 20 μm bei 63-facher Vergrößerung.