Untersuchung einer Hirnverletzung einer Zebrafischlarve mit großflächiger Rastertransmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Kuipers, J. et al., Großskalige Rastertransmissionselektronenmikroskopie (Nanotomie) des gesunden und verletzten Zebrafischgehirns.J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Untersuchung von Hirnverletzungen von Zebrafischlarven mit Hilfe der groß angelegten Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM), einer Technik, die Elemente der Rasterelektronenmikroskopie (REM) und der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) kombiniert, um hochauflösende Bilder zu erzeugen. Es beschreibt die Schritte bei der Vorbereitung von Proben und der Aufnahme von hochauflösenden MINT-Bildern zur Identifizierung von Hirnverletzungen.

Protokoll

>1. Probenvorbereitung

1. Fixierung und Einbettung
   1. Fixierung
      1. Betäuben Sie Fischlarven in Tricain (0,003 %), das dem Zebrafischwasser E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO_4, 10 mM HEPES, pH 7,6) zugesetzt wurde, und testen Sie die Narkosetiefe, indem Sie vorsichtig mit einer 200-μl-Pipettenspitze unter das Dissektionsmikroskop stechen, bis keine Bewegung mehr erkennbar ist (Abbildung 1A).
      2. Bei der Aufbereitung von Proben für die korrelative Elektronenmikroskopie (EM) nach der Aufnahme von In-vivo-Bildgebungsdaten mittels konfokaler oder 2-Photonen-Bildgebung in 1,8 % Agarose wie beschrieben, fixieren Sie die Larven in Agarose mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die Triton-X-100 (0,05 %) enthält.
      3. Larven aus Agarose schneiden und für großflächige EM verarbeiten.
      4. Larven in frischem 4%igem Paraformaldehyd in PBS, das Triton-X-100 (0,05%) enthält, für 2 Std. bei Raumtemperatur in Kunststofftuben fixieren.
         Anmerkung: In Kultur (in vitro) gezüchtete Zellen können direkt in Glutaraldehyd fixiert werden, wie im nächsten Schritt (1.1.1.5) beschrieben.
      5. Entfernen Sie die Lösung und fügen Sie 100 μl 0,5 % PFA, 2 % Glutaraldehyd (GA) und 0,1 M Natriumcacodylat (pH 7,4) hinzu. Über Nacht bei 4 °C lagern. Die Proben werden zweimal in 0,1 M Natriumcacodylat gespült.
      6. Schneiden Sie die Larvenköpfe rostral zum Hinterhirn ab, um das Eindringen von Osmium zu erleichtern. Verwenden Sie feine Spritzen/Pinzetten.
      7. Die Larven in 1 % Osmiumtetroxid (_{OsO 4})/1,5 % Kaliumferrocyanid (K₄[Fe(CN)₆]) in 0,1 M Natriumcacodylat auf Eis für 2 Std. postfixieren und 3 x 5 min in doppelt destilliertem H₂O spülen.
      8. Dehydrieren Sie in Ethanol durch 20-minütige Inkubationen in steigenden Ethanolkonzentrationen (50%, 70%, 3 mal 100%).
   2. Einbettung
      1. Epoxidharz nach Standardrezepten herstellen, die in EM-Laboren verwendet werden.
         Anmerkung: Wir verwenden Epoxidharz wie folgt: Mischen Sie 19,8 g Glycidether 100, 9,6 g 2-Dodecenylbernsteinsäureanhydrid und 11,4 g Methylnadsäureanhydrid mit einem Magnetrührer. 0,5 g DMP-30 (Tris-(Dimethylaminomethyl)phenol) zugeben und erneut mischen.
      2. Inkubieren Sie die Larven über Nacht in 50% Epoxidharz in Ethanol (v/v) während der Rotation (RT).
      3. Ersetzen Sie verdünntes Epoxidharz durch reines Harz. 30 min inkubieren, wieder frisches Harz zugeben und weitere 30 min inkubieren. Das Harz wird erneut aufgefrischt und dann 3 Stunden bei RT inkubiert, gefolgt von 15 Minuten bei 58 °C und weiteren 1 Stunden bei RT unter niedrigem Druck (200 mbar).
      4. Richten Sie die Köpfe in handelsüblichen flachen Einbettungsformen aus Silikon unter einem Präpariermikroskop mit einer Nadel oder einem Zahnstocher aus, wobei der Frontzahn zur Seite der Form zeigt, oder nach Bedarf (Abbildung 1B).
      5. Polymerisieren Sie das Epoxidharz über Nacht bei 58 °C. Wenn das Epoxidharz immer noch zu weich ist, lassen Sie es einen weiteren Tag bei 58 °C polymerisieren und härten. Testen Sie die Steifigkeit, indem Sie mit einer Pinzette Druck ausüben. Wenn dadurch leicht eine Vertiefung entsteht, lassen Sie einen weiteren Tag polymerisieren und bei 58 °C aushärten. Wenn die Probe vollständig ausgehärtet ist, fahren Sie mit dem Trimmen und Trennen fort.
      6. Schneiden Sie überschüssiges Harz mit Rasierklingen vom Stummel ab (Abbildung 1B).
2. Schneiden, Kontrastieren und Montieren
   1. Schnittdarstellung
      1. Schnitt des Epoxidharzblocks mit einem Ultramikrotom.
      2. Verwenden Sie ein Glasmesser oder ein Diamant-Histoknife, um halbdünne Schnitte (500 nm) für die Färbung von Toluidinblau/basischem Fuchsin (Abbildung 1D) zu schneiden, um die richtige Positionierung zu ermitteln.
      3. Übertragen Sie halbdünne Schnitte auf mikroskopisch kleine Objektträger, indem Sie sie mit einer Pasteurpipette aus Glas aufnehmen, deren Spitze durch Schmelzen in einer Flamme verschlossen wurde. Auf einer heißen Platte trocknen, bis kein Wasser mehr übrig ist. 10 sec mit 1 % Toluidinblau in Wasser auf einer heißen Platte färben und nach dem Spülen mit Wasser 10 sec mit 0,05 % basischem Fuchsin in 1 % Natriumtetraborat färben. Untersuchen Sie mit einem normalen Lichtmikroskop bei 10X bis 40X.
      4. Wenn die richtige Stelle/Ausrichtung im Gehirn erreicht ist, fahren Sie mit dem Schneiden des Epoxidharzblocks mit einem Diamantmesser fort, um ultradünne Schnitte (~ 70 nm; Abbildung 1E)
      5. Verwenden Sie leicht identifizierbare anatomische Strukturen im und um das Gehirn, einschließlich Riechgruben, Augen und Grenzen zwischen grauer und weißer Substanz, um den interessierenden Bereich während des ultradünnen Schnitts zu identifizieren und den Schnittwinkel anzupassen, wenn die Probe gekippt wird.
      6. Montieren Sie den Abschnitt auf L2 x 1-Kupfergittern mit einem Steckplatz (Abbildung 1F), um die Erfassung ohne Unterbrechung durch Gitterstäbe zu ermöglichen. Verwenden Sie Formvar-beschichtete Gitter, um die Abschnitte zu stützen.
   2. entgegensetzend
      1. 2 min lang ultradünne Schnitte auf Gittern in 2 % Uranylacetat in Methanol färben, gefolgt von Reynolds-Bleicitrat für weitere 2 min.

>2. Bilderfassung

1. Großskalige Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM)
   Anmerkung: Wir verwenden scannende EM mit einem externen Scan-Generator, der in der Lage ist, mithilfe der STEM-Erkennung mehrere große Sichtfelder mit hoher Auflösung zu erfassen. In der Regel entspricht ein auf diese Weise erzeugtes Bild den Sichtfeldern von ~ 100 Transmissionselektronenmikroskop-Bildern (TEM), wodurch die Menge an Stitching erheblich reduziert wird.
   1. Einbetten einer Probe in ein Mikroskop
      1. Platzieren Sie das Gitter mit dem Abschnitt in den Probenhalter mit mehreren Gittern und übertragen Sie es in die Kammer des REM.
   2. Ausrichtung des STEM-Detektors
      1. Legen Sie das Gitter mit der Probe unter den Strahl und schieben Sie es so nach oben, dass es ca. 5 mm vom Linsenstab entfernt ist. Nehmen Sie ein Bild bei 20 kV mit dem Detektor im Objektiv auf.
      2. Fokussieren Sie sich auf die Rasterkante und stellen Sie den Arbeitsabstand auf 4,0 mm ein.
      3. Bringen Sie den Probenhalter in eine sichere Position und bringen Sie den STEM-Detektor ein.
      4. Zentrieren Sie das Loch des STEM-Detektors im Bildfeld, indem Sie die Einstellschrauben drehen, während Sie mit dem In-Lens-Detektor bei maximaler Geschwindigkeit abbilden.
      5. Bringen Sie den Probenhalter vorsichtig zurück, der gerade zwischen den Linsenstab und den Detektor passt.
      6. Nehmen Sie ein Bild mit dem Detektor im Objektiv auf, um sicherzustellen, dass es sich im Schnittbereich befindet.
      7. Wechseln Sie zur STEM-Erkennung (Verstärkungsmedium und alle Quadranten auf "Minus" eingestellt), nehmen Sie ein Bild auf und wählen Sie den zu scannenden Bereich aus.
      8. Erhöhen Sie die Beschleunigungsspannung auf 21 kV und warten Sie, bis sich der Strahl stabilisiert hat (wieder stabiles Bild), dann gehen Sie in Schritten von 2 kV auf 29 kV.
   3. Erfassen von Bildern
      1. Bestrahlen Sie die Probe vor (um Helligkeitsänderungen durch den Elektronenstrahl zu vermeiden), indem Sie herauszoomen, sodass der gesamte zu scannende Bereich in das Bildfenster passt.
      2. Ändern Sie die Apertur auf 120 μm (um den richtigen Dynamikbereich beizubehalten, müssen die Detektorverstärkungen um eine Stufe reduziert werden).
      3. Defokussieren Sie, sodass das Bild unscharf wird.
      4. Gestalten Sie den gescannten Bereich so eng wie möglich, indem Sie die Option zum Scannen des reduzierten Bereichs verwenden.
      5. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit so ein, dass ein Bild in ca. 1 - 2 Sekunden gescannt wird
         Anmerkung: Je nach Größe und Gewebe dauert dies typischerweise 1/2 h (100 x 100 μm Sichtfeld (FOV)) bis zu 3 h (1.000 x 500 μm).
      6. Zoomen Sie mindestens 100x heran und scannen Sie einen kleinen Bereich für 10 Sekunden
         Anmerkung: Wenn sich die Helligkeit dieses Bereichs im Vergleich zu seiner Umgebung nicht ändert, ist eine Vorbestrahlung ausreichend.
      7. 30 μm Apertur (und STEM-Verstärkung auf Medium) wieder herstellen
      8. Konzentrieren Sie sich auf die Probe.
      9. Richten Sie die Blende mit dem Wobbler aus (bei ~ 40.000-facher Vergrößerung).
      10. Wählen Sie im Fokus den hellsten Bereich/das hellste Merkmal aus und stellen Sie die Scangeschwindigkeit so ein, dass Details sichtbar sind.
      11. Passen Sie in der Mikroskopsoftware Helligkeit und Kontrast an, indem Sie das Histogramm sorgfältig beobachten, um alle Pixel im Dynamikbereich zu halten. Machen Sie dasselbe für die dunkelsten Bereiche/Merkmale.
      12. Gehen Sie zurück in den hellen Bereich und überprüfen Sie erneut. Gehen Sie auf Nummer sicher, damit auf beiden Seiten des Histogramms etwas Platz ist.
      13. Verkleinern Sie die Ansicht, dass der gesamte zu scannende Bereich in das Bildfenster passt, und starten Sie das Programm zur Erfassung großer Bereiche.
      14. Verwenden Sie die Assistentenoption, um ein Mosaik einzurichten, indem Sie einen Bereich auf dem Bildschirm auswählen. Verwenden Sie eine Pixelgröße von 2 - 5 nm, je nachdem, welche Details erforderlich sind. Verwenden Sie eine Verweilzeit von 3 μs für STEM.
      15. Wählen Sie die Option "Autofokus auf vorherige Kachel", verwenden Sie die groß angelegte Erfassungssoftware Autofokus mit den Standardeinstellungen des Unternehmens, aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Einstellung vor der Ausführung überprüfen" und legen Sie fest, wo die Daten gespeichert werden sollen.
      16. Drücken Sie auf "Optimieren", um die Mikroskopeinstellungen zu überprüfen.
          Anmerkung: Nun wird die benötigte Zeit angezeigt. Dies kann bis zu 72 Stunden für Bereiche von 1 x 0,5 mm dauern.
      17. Geben Sie im Fenster den Wert "Maximale Kachelauflösung" auf 20.000 ein, sodass einzelne Kacheln nicht größer als 20 x 20 KB sind, um stumpfe Kanteneffekte zu vermeiden. Drücken Sie auf "Ausführen".
      18. Wenn Sie aufgefordert werden, den Fokus und die Helligkeit/den Kontrast (B/C) zu überprüfen, schalten Sie den externen Scan-Generator aus und passen Sie den Fokus und den Astigmatismus in der Mikroskopsoftware sorgfältig an. B/C.
          nicht ändern Anmerkung: Der Tisch kann verschoben und die Vergrößerung geändert werden, aber die Vergrößerung muss auf die gewünschte Pixelgröße zurückgesetzt werden.
      19. Schalten Sie den externen Scan-Generator wieder ein und drücken Sie auf "Weiter".

Ergebnisse

Abbildung 1: Arbeitsablauf der großflächigen Gewebeelektronenmikroskopie an Zebrafischgehirnen. (ein)7 Tage alte Zebrafischlarven. (B) Zebrafischlarvenköpfe, die nebeneinander in Epoxidharz eingebettet sind. (C) Glasmesser zum halbdünnen Schneiden und Ausrichten der Probe. (D) Repräsentativer halbdünner Toluidinblau gefärbter Schnitt, der zwei ne...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chemikalien
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt	VWR	Artikel-Nr.: 444152G
Tricain	Sigma	Nr. E10521
Triton- X-100	Sigma	X100
Glutaraldehyd	Polywissenschaften	1909
Natriumcacodylat	Sigma	Nr. C0250
Osmiumtetroxid	Elektronenmikroskopie	Nr. 19114
Kaliumferrocyanid (K4[Fe(CN)]6)	Merck	Artikel-Nr.: 4984
Ethanol	VWR	Artikel-Nr.: 20821.365
Uranylacetat	Merck	8473
Natriumtetraborat	Merck	1063808
Tolduidene blau	Merck	Nr. 1273
Grundlegendes Fuchsin	BDH	340324
Bleicitrat	BDH	unterbrochen
EPON
2-Dodecenylbernsteinsäure-Anhydrid	Serva	Artikel-Nr.: 20755
Methylnadisches Anhydrid	Serva	Artikel-Nr.: 29452
Glycidether 100	Serva	Artikel-Nr.: 21045
DMP-30	Polywissenschaften	Nr. 553
Standard-Flacheinbettungsform	Elektronenmikroskopie	70901
Diamant-Messer	Diatome Inc.
Kupfer-Gitter	Elektronenmikroskopie
doppelseitiges Carbonband	Elektronenmikroskopie
Scanning EM Zeiss Supra55	Zeiss
Ultramikrotom Leica EM UC7	Leica
Externer Atlas-Scan-Generator	Fibics

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