Methodenartikel

Differenzierung und Reifung humaner embryonaler Stammzellen zu neuronalen Organoiden

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Cosset, E., et al. Menschliche neuronale Organoide zur Erforschung von Hirntumoren und neurodegenerativen Erkrankungen. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video wird ein schrittweises Protokoll für humane embryonale Stammzellen in neuronale Organoide demonstriert. Die Methode beinhaltet die Induktion der Bildung neuronaler Rosetten, gefolgt von einer kontrollierten Reifung und einer abschließenden Kultivierung auf einer hydrophoben Membran, um voll entwickelte neuronale Organoide zu erhalten.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Erhaltung und Kultivierung undifferenzierter humaner embryonaler Stammzellen (hESCs)

  1. Wartung und Erweiterung von hSECs unter feederfreien Bedingungen durch Vorbeschichtung von Schalen mit einer spezifischen extrazellulären Matrix.
    1. 300 μl extrazelluläre Matrix bei 4 °C auftauen (typische Konzentration im Bereich 18-22 mg/ml, auf Eis halten) und vorsichtig mit 15 ml kaltem DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) mischen, um eine vorzeitige Gelierung der extrazellulären Matrix zu vermeiden. 7,5 ml der extrazellulären Matrix werden in beide T150-Kolben gegeben.
    2. Die mit extrazellulärer Matrix beschichteten Schalen bei 37 °C mindestens 1 h (maximal über Nacht) inkubieren.
    3. Entfernen Sie das Medium und säen Sie die hES-Zellen auf eine Dichte von 6,5 x 104 Zellen/cm2 aus.
  2. H1 (hESC-Zelllinie) wird in hESC-Medium und 1 % Penicillin/Streptomycin beibehalten.
  3. Passieren Sie die Zellen mit einem enzymatischen Verfahren: Geben Sie 7,5 ml enzymatische Lösung über einen Zeitraum von 1-2 Minuten bei 37 °C in einen T75 cm2-Kolben. Sobald die Zellen vollständig abgelöst sind, fügen Sie 7,5 mL DMEM-F12 hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 x g. Um ein besseres Überleben zu ermöglichen, werden die Zellen in der gewünschten Dichte 24 h lang in demselben Medium, das den Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor (10 μM) enthält, wieder auf extrazelluläre Matrix-beschichtete Schalen aufgebracht.

2. hESC-abgeleitete neuronale Organoide

  1. 24 h vor dem Start der 3D-Kultur das hES-Medium durch ein serumfreies Medium ersetzen, das mit einem 10 μM ROCK-Inhibitor ergänzt ist (beide Komponenten sind notwendig, um das Überleben der Zellen und die spontane Neurosphärenbildung während der Aggregationsphase in einer Mikrotiterplatte zu unterstützen). Die Zellen sollten eine Konfluenz von 60 % haben. Am nächsten Tag (Tag 0) lösen Sie die hES-Kolonien in Einzelzellen: Entfernen Sie das Medium, spülen Sie es mit PBS ohne Ca2+/Mg2+, fügen Sie 5 ml enzymatische Auflösungslösung hinzu und inkubieren Sie es 1-2 Minuten lang bei 37 °C.
  2. Sammeln Sie die Zellen in serumfreiem Medium, das mit 10 μM ROCK-Inhibitor versetzt ist, und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 x g. Entfernen Sie den Überstand und zählen Sie die Zellen in 10 mL serumfreiem Medium, das mit 10 μM ROCK-Inhibitor versetzt ist.
  3. Spülen Sie parallel dazu die Mikrotiterplatte mit 2 mL serumfreiem Medium pro Vertiefung und zentrifugieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei 1200 x g, um alle Blasen zu entfernen, die die Bildung von Neurosphären verhindern können.
  4. Bereiten Sie 28,2 x 106 Zellen in 12,5 ml serumfreiem Medium vor, das mit 10 μM ROCK-Inhibitor ergänzt wird. Geben Sie 1000 Zellen/Mikrowelle ab. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min und stellen Sie die Platte über Nacht (maximal 36 h) bei 37 °C in den Inkubator. Um beispielsweise 30 menschliche neuronale Organoide zu erhalten, verwenden Sie einen T150-Kolben bei 70 % bis 80 % der Konfluenz (etwa 30 Millionen Zellen).
  5. Am nächsten Tag (Tag 1) sammeln Sie die Kugeln (mit einem P1000) und legen Sie sie in eine 6-Well-Platte. In jede Vertiefung 2 ml B27-Medium und DMEM-F12 GlutaMAX und Neurobasal-Medium geben (1:1 mischen), ergänzt mit 1 % B27-Ergänzungsmitteln und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA). Um eine schnelle neuronale Induktion zu fördern, ergänzen Sie das Medium mit einem Dual-SMAD-Hemmungscocktail (Sma und Mad Related Protein), der aus 10 μM TGFβ (Transforming Growth Factor-beta)/Activin/Nodal-Inhibitor und 0,5 μM Knochenmorphogenes Protein (BMP)-Inhibitor besteht. Ab diesem Schritt werden die Kugeln in Rotation kultiviert (60 U/min, Orbitalschüttler). Die Drehung ist entscheidend, um zu verhindern, dass die Kugeln aneinander oder an der Platte kleben.
  6. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage: Biegen Sie die Platte und lassen Sie die Kugeln 5 Minuten lang fallen, entfernen Sie die Hälfte des Mediums (2 ml) und fügen Sie 2 ml frisches B27-Medium hinzu, das mit Wachstumsfaktoren und Inhibitoren ergänzt ist. Zentrifugieren Sie die Kugeln nicht.
  7. Führen Sie die neuronale Induktion gemäß dem folgenden Zeitverlauf durch:
    1. Von Tag 1-4 kultivieren Sie die Kugeln in B27 Medium, ergänzt mit Dual-SMAD. Der duale SMAD-Hemmungscocktail (10 μM TGFβ/Activin/Nodal-Inhibitor und 0,5 μM BMP-Inhibitor) fördert die neuronale Induktion.
    2. Fördern Sie von den Tagen 4 bis 11 die Proliferation von hESC-abgeleiteten neuralen Rosetten (in die Kugeln), indem Sie 10 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 10 ng/ml basischen Fibroblastenfaktor (bFGF) zum B27-Medium hinzufügen, ergänzt mit einem Dual-SMAD-Cocktail.
      Anmerkung: Am Tag 11 sollten die meisten Zellen positiv für Nestin sein.
    3. Von den Tagen 11-13 kultivieren Sie die Kugeln in B27-Medium, das mit 0,5 μM BMP-Inhibitor ergänzt wurde.
    4. Von den Tagen 13 bis 21 kultivieren Sie die Kugeln in B27-Medium, ergänzt mit 10 ng/ml glialem abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF), 10 ng/ml hirnabgeleitetem neurotrophen Faktor (BDNF) und 1 μM γ-Sekretase-Inhibitor. GDNF und BDNF fördern die neuronale und gliale Differenzierung. Der γ-Sekretase-Inhibitor ermöglicht eine größere neuronale Reifung.
    5. An Tag 21 plattieren Sie die Kugeln (ca. 1.000 Kugeln) auf einer hydrophilen Polytetrafluorethylen (PTFE)-Membran (6 mm Durchmesser, 0,4 μm), die auf einem für 6-Well-Platten ausgelegten Kulturplatteneinsatz abgeschieden ist. Stoppen Sie alle Drehungen in diesem Schritt. Das Vorhandensein von Rosetten, das mit einem Hellfeldmikroskop beobachtet wurde, deutet auf die Initiierung der neuronalen Differenzierung hin. Die Neuralrosetten können 2-3 Tage nach dem Plattieren der Kugeln auf der PTFE-Membran beobachtet werden.
    6. Geben Sie alle 2-3 Tage (normalerweise am Montag, Mittwoch und Freitag) 1 ml B27-Medium, das mit Wachstumsfaktoren und Inhibitoren (wie folgt) ergänzt ist, in jede Vertiefung unter dem Membraneinsatz, für die folgenden 3 Wochen der Differenzierung.
    7. Kultivieren Sie von Tag 21 bis 25 menschliche neuronale Organoide im selben neuronalen Reifungsmedium.
    8. Ergänzen Sie B27-Medium von Tag 25 bis 28 nur mit 1 μM γ-Sekretase-Hemmer.
    9. Beenden Sie von den Tagen 28 bis 39 die Zugabe des γ-Sekretase-Inhibitors und setzen Sie die humane neuronale Organoidkultur nur im B27-Medium fort.
      Anmerkung: Nach 3 Wochen sind die neuronalen Organoide bereit für die GIC-Implantation. Entlang der neuronalen Reifung wurde eine Abnahme des neuronalen unreifen Markers Nestin und ein Anstieg der reifen neuronalen Marker β3-Tubulin und GFAP beobachtet.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Well-Platte (6-Well-Platte)Falke / CorningTel.: 07-201-588
Aggrewell 400 (Mikrotiterplatten)StemCell-TechnologienArtikel-Nr.: 34421
B27 Zuschläge (B27)Life Technologies / InvitrogenNr. 1238Für beide Protokolle, Stammlösung 100x, 1x
Vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF)Zell-FührungGFH1-2Für beide Protokolle, Stammlösung 100 μg/mL in reinem H2O, 20 ng/mL
Verbindung E ein γ-Sekretase-Hemmer (γ-Sekretase-Hemmer)CalbiochemArtikel-Nr.: 209986-17-4Für beide Protokolle (Gamma-Sekretase-Inhibitor XXI), Stammlösung 5 mM in DMSO, endgültige Lösung 1 μM
Dimethylsulfoxid rein (DMSO)Sigma-AldrichNr. C6164Lösemittelverbindungen, gebrauchsfertig
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)LebenstechnologienArtikel-Nr.: 12491-015Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12)Gibco11320033Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
EDTA 0,1 mM (EDTA)LebenstechnologienAM9912Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
Gliazellabgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF)Zell-FührungGFH2-2Für beide Protokolle, Stammlösung 100 μg/mL in reinem H2O, 20 ng/mL
Hydrophile Polytetrafluorethylen-Membran (PTFE-Membran)BioCell-Schnittstelleunterbrochen
LDN-193189 (BMP-Hemmer)Axon Medchem /StemgenTel.: 04-0072-02 /1509Dual/Smad, Stammlösung 5 mM in DMSO, 0,5 μM
L-Glutamin (L-Glutamin)Gibco25030081L-Glutamin (200 mM), Stammlösung 200 mM, 2 mM
Matrigel (extrazelluläre Matrix)BD Biowissenschaften354277hESC-qualifizierte Matrix, Stammlösung 18-22 mg/mL, 180-220 μg/mL
Millicell-CM Kulturplatteneinsatz (0,4 μm) (Kulturplatteneinsatz)MilliporePICM03050
Monoklonaler Anti-β-Tubulin III AntikörperSigmaNr. T86601/1000 Verdünnung
MS Orbitalschüttler, MS-NOR-30 (Orbitalschüttler)Schwerpunkt WissenschaftMS-NRC-30
Neurobasal (Neurobasal)Life Technologies / Gibco21103049Erhaltung und Reifung embryonaler neuronaler Zellpopulationen, gebrauchsfertig
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)GibcoArtikel-Nr.: 11140Nicht-essentielle Aminosäuren 100X, Stammlösung 100x, 1x
Nurr1 Antikörper (M-196)Santa CruzNr. Sc-55681/100 Verdünnung
Nutristem (hESC medium )Biologische Industrien05-100-1AStammzellmedien, gebrauchsfertig
Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin )Life Technologies / Gibco15140122Für Zellkulturen, Stammlösung 5 mg/ml, 50 μg/ml
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+/Mg2+ (PBS ohne Ca2+/Mg2+ )Lebenstechnologien14190250Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
Rho-assoziierte Kinase Y-27632 (ROCK)Abcam BiochemikalienArtikel-Nr.: ab120129-1Gesteinsinhibitor, Stammlösung 50 mM in DMSO, 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activin/Knoten-Inhibitor)AufstiegAsc- 163Dual-Smad, Stammlösung 50 mM in DMSO, 10 μM
StemPro Accutase (enzymatische hESC-Lösung)GibcoNr. A11105-01hESC enzymatische Lösung, gebrauchsfertig
T150 Kolben (T150 Kolben)Falke08-772-1F
Transformation von Wachstumsfaktoren beta 3 (TGFβ3)Zell-FührungGFH109-2Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 100 μg/ml in reinem Ethanol, 1 ng/ml
Trypsin 0,25% (enzymatische Lösung)Lebenstechnologien15050065enzymatische Lösung, gebrauchsfertig
X-vivo (serumfreies Medium)LonzaBE04-743QSerumfreies Medium, bereit für Sie

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Bildung neuraler Rosettenduale SMAD Inhibitionhydrophobe MembrankulturLuft Fl ssigkeit Grenzfl chewachstumsfaktorreiches Mediuminhibitorreiches ReifungsmediumInduktion neuraler Vorl uferzellenDifferenzierung glialer Zellen

Verwandte Artikel