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Methodenartikel

Differenzierung und Reifung humaner embryonaler Stammzellen zu neuronalen Organoiden

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8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Cosset, E., et al. Menschliche neuronale Organoide zur Erforschung von Hirntumoren und neurodegenerativen Erkrankungen. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video wird ein schrittweises Protokoll für humane embryonale Stammzellen in neuronale Organoide demonstriert. Die Methode beinhaltet die Induktion der Bildung neuronaler Rosetten, gefolgt von einer kontrollierten Reifung und einer abschließenden Kultivierung auf einer hydrophoben Membran, um voll entwickelte neuronale Organoide zu erhalten.

Protokoll

1. Erhaltung und Kultivierung undifferenzierter humaner embryonaler Stammzellen (hESCs)

  1. Wartung und Erweiterung von hSECs unter feederfreien Bedingungen durch Vorbeschichtung von Schalen mit einer spezifischen extrazellulären Matrix.
    1. 300 μl extrazelluläre Matrix bei 4 °C auftauen (typische Konzentration im Bereich 18-22 mg/ml, auf Eis halten) und vorsichtig mit 15 ml kaltem DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) mischen, um eine vorzeitige Gelierung der extrazellulären Matrix zu vermeiden. 7,5 ml der extrazellulären Matrix werden in beide T150-Kolben gegeben.
    2. Die mit extrazellulärer Matrix beschichteten Schal....

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Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Well-Platte (6-Well-Platte)Falke / CorningTel.: 07-201-588
Aggrewell 400 (Mikrotiterplatten)StemCell-TechnologienArtikel-Nr.: 34421
B27 Zuschläge (B27)Life Technologies / InvitrogenNr. 1238Für beide Protokolle, Stammlösung 100x, 1x
Vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF)Zell-FührungGFH1-2Für beide Protokolle, Stammlösung 100 μg/mL in reinem H2O, 20 ng/mL
Verbindung E ein γ-Sekretase-Hemmer (γ-Sekretase-Hemmer)CalbiochemArtikel-Nr.: 209986-17-4Für beide Protokolle (Gamma-Sekretase-Inhibitor XXI), Stammlösung 5 mM in DMSO, endgültige Lösung 1 μM
Dimethylsulfoxid rein (DMSO)Sigma-AldrichNr. C6164Lösemittelverbindungen, gebrauchsfertig
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)LebenstechnologienArtikel-Nr.: 12491-015Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12)Gibco11320033Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
EDTA 0,1 mM (EDTA)LebenstechnologienAM9912Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
Gliazellabgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF)Zell-FührungGFH2-2Für beide Protokolle, Stammlösung 100 μg/mL in reinem H2O, 20 ng/mL
Hydrophile Polytetrafluorethylen-Membran (PTFE-Membran)BioCell-Schnittstelleunterbrochen
LDN-193189 (BMP-Hemmer)Axon Medchem /StemgenTel.: 04-0072-02 /1509Dual/Smad, Stammlösung 5 mM in DMSO, 0,5 μM
L-Glutamin (L-Glutamin)Gibco25030081L-Glutamin (200 mM), Stammlösung 200 mM, 2 mM
Matrigel (extrazelluläre Matrix)BD Biowissenschaften354277hESC-qualifizierte Matrix, Stammlösung 18-22 mg/mL, 180-220 μg/mL
Millicell-CM Kulturplatteneinsatz (0,4 μm) (Kulturplatteneinsatz)MilliporePICM03050
Monoklonaler Anti-β-Tubulin III AntikörperSigmaNr. T86601/1000 Verdünnung
MS Orbitalschüttler, MS-NOR-30 (Orbitalschüttler)Schwerpunkt WissenschaftMS-NRC-30
Neurobasal (Neurobasal)Life Technologies / Gibco21103049Erhaltung und Reifung embryonaler neuronaler Zellpopulationen, gebrauchsfertig
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)GibcoArtikel-Nr.: 11140Nicht-essentielle Aminosäuren 100X, Stammlösung 100x, 1x
Nurr1 Antikörper (M-196)Santa CruzNr. Sc-55681/100 Verdünnung
Nutristem (hESC medium )Biologische Industrien05-100-1AStammzellmedien, gebrauchsfertig
Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin )Life Technologies / Gibco15140122Für Zellkulturen, Stammlösung 5 mg/ml, 50 μg/ml
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+/Mg2+ (PBS ohne Ca2+/Mg2+ )Lebenstechnologien14190250Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
Rho-assoziierte Kinase Y-27632 (ROCK)Abcam BiochemikalienArtikel-Nr.: ab120129-1Gesteinsinhibitor, Stammlösung 50 mM in DMSO, 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activin/Knoten-Inhibitor)AufstiegAsc- 163Dual-Smad, Stammlösung 50 mM in DMSO, 10 μM
StemPro Accutase (enzymatische hESC-Lösung)GibcoNr. A11105-01hESC enzymatische Lösung, gebrauchsfertig
T150 Kolben (T150 Kolben)Falke08-772-1F
Transformation von Wachstumsfaktoren beta 3 (TGFβ3)Zell-FührungGFH109-2Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 100 μg/ml in reinem Ethanol, 1 ng/ml
Trypsin 0,25% (enzymatische Lösung)Lebenstechnologien15050065enzymatische Lösung, gebrauchsfertig
X-vivo (serumfreies Medium)LonzaBE04-743QSerumfreies Medium, bereit für Sie

Tags

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