Erzeugung dopaminerger neuronaler Organoide aus humanen embryonalen Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Cosset, E. et al. Menschliche neuronale Organoide zur Erforschung von Hirntumoren und neurodegenerativen Erkrankungen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) in dopaminerge Neuronen, um ein Modell für die Untersuchung der Parkinson-Krankheit bereitzustellen. Die hES-Zellen werden in einem neuronalen Induktionsmedium in einer Mikrotiterplatte kultiviert, um 3D-Neurosphären zu bilden. Diese werden dann in einem neuronalen Induktionsmedium kultiviert, um die Differenzierung in dopaminerge Vorläuferneuronen zu fördern. Die endgültige Reifung der Neuronen erfolgt in einem Kultureinsatz unter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenbedingungen, was zu 3D-Organoiden führt, die aus reifen dopaminergen Neuronen bestehen.

Protokoll

>1. hESC-abgeleitete dopaminerge Organoide für Studien zur Parkinson-Krankheit (PD)

1. Tag 0: Amplifizieren Sie hES-Zellen in 2D-Kulturen auf bis zu 60 % Konfluenz (Tag 0), ersetzen Sie dann das Stammzellmedium, das zur Aufrechterhaltung der Pluripotenzmerkmale von hES-Zellen verwendet wird, durch ein serumfreies Medium. Beginnen Sie die neuronale Induktion, indem Sie das Kulturmedium mit 0,5 μM BMP-Inhibitor (Bone Morphogenetic Protein) und 10 μM Transforming Growth Factor Beta (TGFβ)/Activin/Nodal-Inhibitor (Dual-SMAD-Hemmungscocktail) ergänzen und dann 24 Stunden lang 10 μM Rho-assoziierte Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor hinzufügen, um die Überlebensrate der Zellen während der Passage zu erhöhen.
2. Tag 1: Bereiten Sie die Mikrotiterplatte mit 2,5 ml serumfreiem Medium pro Vertiefung vor, das mit 0,5 μM BMP-Inhibitor, 10 μM TGFβ/Activin/Nodal-Inhibitor und 10 μM ROCK-Inhibitor ergänzt wird. Um Zellen in Richtung des ventralen Musters des Neuralrohrs zu spezifizieren, fügen Sie 100 ng/mL sonic hedgehog (SHH), 100 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 (FGF8) und 2 μM geglätteten Agonisten hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte (nur mit Medium und ohne Zellen) bei 1200 x g für 5 min, um Luftblasen aus den Mikrovertiefungen zu entfernen.
   1. Nach 1 Tag neuronaler Induktion in 2D entfernen Sie das Medium und waschen Sie es schnell mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca²⁺/MgCl²⁺. Dissoziieren Sie die Kolonien in Einzelzellsuspension durch Zugabe von 7,5 ml rekombinanter enzymatischer Lösung in einen T75 cm^2-Kolben. 2 min bei 37 °C inkubieren und dann mit 7,5 mL des modifizierten Eagle-Medium-Nährstoff-Gemischs F-12 (DMEM-F12) von Dulbecco vervollständigen.
   2. Die Zellsuspension auffangen und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und zählen Sie die Zellen in demselben Medium, das zur Vorbereitung der Mikrotiterplatte verwendet wurde.
   3. Passen Sie das mittlere Volumen an, um eine Zellsuspension zu erhalten, die es ermöglicht, Neurosphären mit 1000 Zellen pro Mikrovertiefung zu bilden (z. B. enthält die hier verwendete Mikrotiterplatte 4.700 Mikrovertiefungen pro Vertiefung). Bereiten Sie also 4,7 Millionen Zellen in 2,5 ml Medium vor und fügen Sie es zu den vorherigen 2,5 ml Medium hinzu, die bereits in der Platte platziert sind.
   4. Um die Zellen korrekt in den einzelnen Mikrotiterplatten zu verteilen, schütteln Sie die Platte vorsichtig und zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatte 5 Minuten lang auf 300 x g. Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C, um Kugeln zu erzeugen.
3. Tag 2: Spülen Sie die Mikrowells vorsichtig mit dem Medium und sammeln Sie die Kugeln, dann übertragen Sie sie in eine gewebebehandelte Sechs-Well-Platte. Ersetzen Sie das Medium durch Neurobasalmedium, das mit 1 % B27, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 2 mM L-Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt wird. Fügen Sie zusätzlich die Regionalisierungsfaktoren SHH, FGF8, geglätteten Agonisten und duale SMAD-Hemmung kleiner Moleküle hinzu.
   1. Kugeln bei 37 °C (60 U/min, Orbitalschüttler) in Rotation stellen und alle 2-3 Tage das halbe Medium frisch ergänzt wechseln.
4. Tag 3: Um die neuronale Induktion zu verbessern und in neuronale Vorläuferzellen mit einer Mittelhirnidentität umzuwandeln, ergänzen Sie das Medium mit einem 3 μM Glykogensynthase-Kinase-3 beta (GSK-3β)-Inhibitor, der den Wnt/β-Catenin-Signalweg aktiviert. Halten Sie den GSK-3β-Inhibitor bis zum 13. Tag im Medium. Aufgeteilt in zwei neue, gewebebehandelte 6-Well-Platten, um sowohl die Kugeldichte pro Well zu reduzieren als auch eine Kugelaggregation zu vermeiden.
   Anmerkung: An Tag 8 sollten die meisten Zellen positiv für Nestin sein.
5. Tag 8: Beginn der neuronalen Reifung: Ersetzen Sie die Regionalisierungsfaktoren SHH, FGF8, geglätteten Agonisten und Dual-SMAD-Hemmungscocktail durch 0,5 mM Dibutyrylcyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) (zur Begünstigung der Reifung), 20 nM Inhibitor der Histon-Deacetylase (für den Ausgang des Zellzyklus), 1 μM γ-Sekretase-Inhibitor und Wachstumsfaktoren, 10 ng/ml Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF), 10 ng/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF), 1 ng/ml transformierender Wachstumsfaktor β3 (TGFβ3) und 5 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor 20 (FGF20) (beide begünstigen das Überleben der dopaminergen [DA] Vorläufer). Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
6. Tag 21: Erzeugung des neuronalen Organoids: Aussaat von etwa 100 Neurosphären unter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenbedingungen auf Polytetrafluorethylen (PTFE-Membran, 6 mm Durchmesser). Übertragen Sie die Membran auf eine Kulturplatte (0,4 mm) und fügen Sie 1,2 ml neuronales Reifungsmedium hinzu, das für die Differenzierung der Neurosphäre verwendet wird, wie zuvor beschrieben.
   1. Stoppen Sie alle Drehungen in diesem Schritt. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage, bis der gewünschte Differenzierungszeitpunkt erreicht ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-Well-Platte (6-Well-Platte)	Falke / Corning	Tel.: 07-201-588
Aggrewell 400 (Mikrotiterplatten)	StemCell-Technologien	Artikel-Nr.: 34421
B27 Zuschläge (B27)	Life Technologies / Invitrogen	Nr. 1238	Für beide Protokolle, Stammlösung 100x, 1x
Vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF)	Zell-Führung	GFH1-2	Für beide Protokolle, Stammlösung 100 μg/mL in reinem H2O, 20 ng/mL
CHIR-99021 (GSK-3β-Inhibitor)	Axon Medchem	CT99021	Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 7,5 mM in DMSO, 3 μM
Verbindung E ein γ-Sekretase-Hemmer (γ-Sekretase-Hemmer)	Calbiochem	Artikel-Nr.: 209986-17-4	Für beide Protokolle (Gamma-Sekretase-Inhibitor XXI), Stammlösung 5 mM in DMSO, endgültige Lösung 1 μM
Dibutyrylcyclic-AMP (Dibutyryl cAMP)	Sigma	Nr. D0627	Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 0,5 M in DMSO, endgültige Lösung 0,5 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12)	Gibco	11320033	Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Lebenstechnologien	AM9912	Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
Fibroblasten-Wachstumsfaktor 20 (FGF20)	Peprotech	Nr. 100-41	Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 100 μg/ml in reinem H2O, endgültige Lösung 5 ng/ml
Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 (FGF8)	Peprotech	GFH176-5	Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 100 μg/ml in reinem H2O, 100 ng/ml
Gliazellabgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF)	Zell-Führung	GFH2-2	Für beide Protokolle, Stammlösung 100 μg/mL in reinem H2O, 20 ng/mL
Hydrophile Polytetrafluorethylen-Membran (PTFE-Membran)	BioCell-Schnittstelle	unterbrochen
LDN-193189 (BMP-Hemmer)	Axon Medchem /Stemgen	Tel.: 04-0072-02 /1509	Dual/Smad, Stammlösung 5 mM in DMSO, 0,5 μM
L-Glutamin (L-Glutamin)	Gibco	25030081	L-Glutamin (200 mM), Stammlösung 200 mM, 2 mM
Millicell-CM Kulturplatteneinsatz (0,4 μm) (Kulturplatteneinsatz)	Millipore	PICM03050
MS Orbitalschüttler, MS-NOR-30 (Orbitalschüttler)	Schwerpunkt Wissenschaft	MS-NRC-30
N2-Ergänzungen (N2)	Invitrogen	Artikel-Nr.: 17502-048	Für GIC-Kultur, Stammlösung 100x, 1x
Neurobasal (Neurobasal)	Life Technologies / Gibco	21103049	Erhaltung und Reifung embryonaler neuronaler Zellpopulationen, gebrauchsfertig
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)	Gibco	Artikel-Nr.: 11140	Nicht-essentielle Aminosäuren 100X, Stammlösung 100x, 1x
Nutristem (hESC medium )	Biologische Industrien	05-100-1A	Stammzellmedien, gebrauchsfertig
Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin )	Life Technologies / Gibco	15140122	Für Zellkulturen, Stammlösung 5 mg/ml, 50 μg/ml
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+/Mg2+ (PBS ohne Ca2+/ Mg2+)	Lebenstechnologien	14190250	Für die Zellkultur, gebrauchsfertig
Purmorphamin (geglätteter Agonist)	Calbiochem	SML0868	Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 10 mM in DMSO, endgültige Lösung 2 μM
Rho-assoziierte Kinase Y-27632 (ROCK)	Abcam Biochemikalien	Artikel-Nr.: ab120129-1	Gesteinsinhibitor, Stammlösung 50 mM in DMSO, 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activin/Knoten-Inhibitor)	Aufstieg	Asc- 163	Dual-Smad, Stammlösung 50 mM in DMSO, 10 μM
Sonic Hedgehog (SHH)	Zell-Führung	GFH168-5	Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 100 μg/ml in reinem H2O, 100 ng/ml
StemPro Accutase (enzymatische hESC-Lösung)	Gibco	Nr. A11105-01	hESC enzymatische Lösung, gebrauchsfertig
T150 Kolben (T150 Kolben)	Falke	08-772-1F
Transformation von Wachstumsfaktoren beta 3 (TGFβ3)	Zell-Führung	GFH109-2	Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 100 μg/ml in reinem Ethanol, 1 ng/ml
Trichostatin A (Inhibitor der Histon-Deacetylase )	Sigma	Nr. T8552	Für das dopaminerge Protokoll, Stammlösung 100 μM in DMSO, 20 nM
TrypLE (rekombinante enzymatische Lösung)	Invitrogen	12604021	Rekombinante enzymatische Lösung, gebrauchsfertig
Trypsin 0,25% (enzymatische Lösung)	Lebenstechnologien	15050065	enzymatische Lösung, gebrauchsfertig
X-vivo (serumfreies Medium)	Lonza	BE04-743Q	serumfreies Medium, gebrauchsfertig