HINWEIS: Zu den in dieser Studie verwendeten transgenen Linien gehören die Makrophagen-spezifische Linie mpeg1:mCherry (im eigenen Haus konstruiert), neutrophilenspezifische mpo: GFP, erythroid-spezifisches gata1:dsRed und ubiq:secAnnexinV-mVenus, ein Reporter für den Zelltod (im Haus regeneriert) auf Wildtyp-, Perlmutt- (mitfaw2/w2) und mutierten (bbhm292) Hintergründen.
>1. Tag 0: Eierproduktion und -sammlung
- Sammeln Sie befruchtete Embryonen aus natürlichem Laichen in Zuchtboxen, die aus 1 männlichen und 1-2 weiblichen erwachsenen Zebrafischen hergestellt wurden.
Anmerkung: Für das Atorvastatin-Protokoll können beliebige Wildtyp-/transgene Tiere verwendet werden; Die Blutungsraten unterscheiden sich jedoch leicht zwischen den Stämmen.
- Inkubieren Sie 100 Embryonen bei 28 °C in Standard-E3-Embryomedium pro Petrischale und Stadium gemäß den Standardrichtlinien.
- Entfernen Sie ~6 Stunden nach der Befruchtung (hpf) tote und unbefruchtete Embryonen mit einer Pasteur-Pipette aus der Schale. Abbildung 1 zeigt die experimentelle Zeitachse.
>2. Tag 1: Behandlung mit Atorvastatin bei 24 hpf
- Dechorionieren Sie Embryonen für die Behandlung mit Atorvastatin mit einer scharfen, ultradünnen Dissektionszange. Die für das Experimentieren benötigten Zahlen können entsprechend angepasst werden.
- Geben Sie 30 ml E3-Embryomedium in zwei saubere Petrischale. Verwenden Sie eine Schale für 100 Embryonen.
Anmerkung: Sind Platten für die Zellkultur konzipiert, bleiben dechorionierte Zebrafische in diesem frühen Stadium oft am Boden haften. Um dies zu vermeiden, spülen Sie die Platten vor Gebrauch gründlich mit klarem Wasser ab.
- Nehmen Sie 60 μl Embryowasser von der Behandlungsplatte und fügen Sie 60 μl 0,5 mM Atorvastatin (ATV) hinzu. Bei einer Stammkonzentration von 0,5 mM führt die obige Verdünnung zu einer Endkonzentration von 1 μM, was zu ~20 % der nicht blutenden Larven (ICH-) und ~80 % der blutenden Larven (ICH+) führt. Verwenden Sie die andere Platte für unbehandelte Steuerungen.
Anmerkung: Atorvastatin wird in destilliertem Wasser (3 mg in 10 ml) zu einer 0,5 mM Stammlösung gelöst. Über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Rühren inkubieren, da die Solubilisierung einige Zeit in Anspruch nimmt. Die vollständige Solubilisierung kann bis zu 1 Woche dauern. DMSO (Dimethylsulfoxid) darf nicht verwendet werden. Die Lösung wird aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Nicht einfrieren und auftauen.
- Mit einer Pasteur-Pipette werden 100 Embryonen in so wenig Wasser wie möglich auf die Behandlungsplatten übertragen.
- Inkubieren Sie die Platten bei 28 °C.
Anmerkung: ICH (intrazerebrale Blutung) tritt zwischen 33 und 48 hpf auf. Atorvastatin muss nicht entfernt werden, da eine Inkubation von mehr als 24 Stunden keine weiteren Entwicklungsprobleme verursacht.
>3. Tag 2: Trennung von ICH- und ICH+-Populationen bei 50 hpf
- Trennen Sie ICH+-Fische von ICH-Populationen und geben Sie sie zur Vereinfachung in neue Gerichte.
- Wenn das ATV-Modell in einer Konzentration von 1 μM verwendet wird, zeigen 75-100 % der Larven zu diesem Zeitpunkt Blutungen (ICH+).
Anmerkung: Die Reaktion der Larven ist von Stamm zu Stamm unterschiedlich, wenn die Larven nicht mit der gewünschten Häufigkeit bluten, verwenden Sie eine frische Charge Atorvastatin oder eine höhere Konzentration. Wenn die Larven keine Blutungen von 48 hpf gezeigt haben, dann betrachten Sie sie als ICH-.
- Bei Verwendung des bbh-Modells zeigen alle homozygoten Mutanten eine Blutung von 48 hpf. Bei Verwendung einer heterozygoten Inkreuzung können die ICH-heterozygoten und Wildtyp-Geschwister als Kontrolltiere für Versuche verwendet werden.
- Falls erforderlich, betäuben Sie die Larven durch Zugabe von 0,02 % MS222 zum E3-Medium. Mit einer Pasteur-Pipette die Larven auf das Vorhandensein von Blut im Kopf in frisches E3-Medium sortieren. Siehe Abbildung 2.
Anmerkung: Blut im Kopf kann im Vorder-, Mittel- oder Hinterhirn oder in Kombination auftreten, und das Blutungsvolumen kann von Tier zu Tier variieren. Bei den bbh-Mutanten ist die ICH oft mit einem schweren Ödem verbunden, das sich an größeren Köpfen, einem größeren Augenabstand und einer diffuseren Blutung erkennen lässt. Allerdings weisen nicht alle ICH+ bbh-Larven Ödeme auf.
