Immunfluoreszenzfärbung von Sialoglykoproteinen in neuralen Vorläuferzellen und Neuronen

Zusammenfassung

Quelle: Bai, Q., et al., Identifizierung von Zelloberflächenmarkern primärer neuraler Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Markierung von Sialglykan. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert die Biotinylierung und Fluoreszenzmarkierung von modifizierten Sialglykoproteinen in primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen sowie Neuronen und deren Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Protokoll

>1. Immunfluoreszenzfärbung von Sialoglykoproteinen in expandierten primären NSPCs und differenzierten Neuronen

1. BTTAA-CuSO₄ Komplex 1 30x Brühe mit 1,5 mM CuSO₄ und 9 mM BTTAA in doppelt destilliertem Wasser zubereiten. Bereiten Sie frisch biotin-konjugierten Puffer 1 vor, der 50 μM Biotin-Alkin, 2,5 mM Natriumascorbat und 1x BTTAA-CuSO_4-Komplex in PBS enthält.
2. Entfernen Sie die Einsätze von den Co-Kulturplatten. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den unteren Vertiefungen und waschen Sie die Nervenzellen einmal mit vorgewärmtem PBS.
3. Aspirieren Sie das PBS aus den Vertiefungen. Geben Sie 1 ml vorgekühlte 4%ige Paraformaldehyd-PBS-Lösung pro Vertiefung in die Zellen und fixieren Sie sie 10 Minuten lang bei RT. Waschen Sie dann die Zellen 3 Mal mit vorgekühltem PBS.
4. Aspirieren Sie PBS aus den Vertiefungen und geben Sie 1 ml frisch zubereiteten Biotin-konjugierten Puffer 1 pro Vertiefung in die Zellen. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei RT.
5. Aspirieren Sie den Reaktionspuffer aus den Vertiefungen. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS. Bereiten Sie den Färbepuffer vor, der 1 % FBS und 1 μg/ml Alexa Fluor 647-Streptavidin enthält. Geben Sie 1 ml Färbepuffer pro Vertiefung in die Zellen und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei RT.
6. Saugen Sie den Färbepuffer aus den Vertiefungen an und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit vorgekühltem PBS. Bereiten Sie den Blockierungspuffer vor, der 5 % BSA und 0,3 % nichtionisches Detergens-100 in PBS enthält. Geben Sie 1 ml Blockierungspuffer pro Vertiefung in die Zellen und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
7. Bereiten Sie eine primäre Antikörperlösung vor, indem Sie die Anti-Nestin- und Anti-β-Tubulin-III-Antikörper zusammen in den Blockierungspuffer im Verhältnis 1:20 bzw. 1:1.000 verdünnen. Entfernen Sie den Blockierungspuffer aus den Vertiefungen und geben Sie 1 ml Primärantikörperlösung pro Vertiefung in die Zellen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 4 °C.
8. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus den Vertiefungen. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit vorgekühltem PBS. Bereiten Sie eine Sekundärantikörperlösung vor, indem Sie Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG1, Alexa Fluor 546 Ziegen-Anti-Maus-IgG2b und DAPI zusammen in Blockierungspuffer in einer Verdünnung von 1:1.000 verdünnen. Aspirieren Sie das PBS aus den Vertiefungen und geben Sie 1 ml Sekundärantikörperlösung pro Vertiefung in die Zellen. Inkubieren Sie die Zellen 2 Stunden lang bei RT.
9. Aspirieren Sie die Antikörperlösung aus den Vertiefungen und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit vorgekühltem PBS. Danach sind die Zellen bereit für die Bildaufnahme.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fötales Rinderserum	Gibco	10099141	10 %
Paraformaldehyd	Sigma	158127	4 %
DAPI	Gibco	Artikel-Nr.: 62248
6-Well-Platte	Corning	3335
Monoklonales Anti-Nestin der Maus	Entwicklungsstudie Hybridom-Bank	Ratte-401	1 bis 20
Monoklonales Anti-Beta-Tubulin III der Maus	Sigma	Nr. T8860	1 bis 1000
Alexa Fluor 488 Anti-Maus IgG1	Invitrogen	Nr. A-21121	1 bis 1000
Alexa Fluor 546 Anti-Maus IgG2b	Invitrogen	Nr. A-21143	1 bis 1000
Triton X-100	Amresco	694
Kupfersulfat	Sigma	209198
Alkin-Biotin	Klicken Sie auf Chemiewerkzeuge	TA105
BTTAA	Klicken Sie auf Chemiewerkzeuge	Nr. 1236
Natriumascorbat	Sigma	Nr. A4034
Alexa Mehl 647-konjugiertes Streptavidin	Invitrogen	Nr. S21374	1 bis 1000

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