In-vitro-Bewertung von aggregiertem Amyloid-β auf den Kollaps des neuronalen Wachstumskegels

Zusammenfassung

Quelle: Kuboyama, T. Visualisierung des Kollapses des axonalen Wachstumskegels und der frühen Amyloid-β-Effekte in kultivierten Mausneuronen. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt eine In-vitro-Bewertung des neuronalen Wachstumskegelkollapses durch Amyloid-β (Aβ)-Aggregate. Die Behandlung der Neuronen mit Aβ-Aggregaten führt zu einer Destabilisierung des Zytoskeletts, die zum Kollaps der Wachstumskegel an der Spitze der Axone führt. Die behandelten Zellen werden mit Kontrollzellen verglichen, um das Ausmaß des Zusammenbruchs des Wachstumskegels zu beurteilen.

Protokoll

>1. Assay einklappen

1. Poly-D-Lysin-Beschichtung
   1. Beschichten Sie 8-Well-Kulturobjektträger mit 400 μl 5 μg/ml Poly-D-Lysin (PDL) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
   2. Entfernen Sie die PDL-Lösung und waschen Sie die Vertiefungen 3 Mal mit destilliertem Wasser.
2. Neuronen-Kultur
   1. Zerkleinern Sie frisch isolierte Großhirnrinde von embryonalen Tag 14 (E14) ddY (Deutschland, Denken und Yoken) Mäusen mit einer Mikroschere in einem Neuronenkulturmedium, das 12 % Pferdeserum, 0,6 % Glukose und 2 mM L-Glutamin (Medium A) enthält. Fügen Sie keine Antibiotika hinzu.
      Anmerkung: In diesem Protokoll wird die ddY-Maus verwendet. Dabei handelt es sich um eine ausgezüchtete Sorte, die in Japan häufig verwendet wird. Dieses Neuronenkulturprotokoll kann auch auf kortikale Neuronen von Ratten angewendet werden.
   2. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 87 x g für 3 min.
   3. Entfernen Sie den Überstand. Geben Sie dann 2 ml 0,05 % Trypsin in das Pellet und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 37 °C. Mischen Sie, indem Sie alle 5 Minuten klopfen.
   4. Fügen Sie 4 ml Medium A hinzu und mischen Sie es durch Klopfen.
   5. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 178 x g für 3 min.
   6. Entfernen Sie den Überstand und inkubieren Sie das Gewebe mit 600 U/ml Desoxyribonuklease I (DNase I) und 0,3 mg/ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, gelöst in PBS für 15 min bei 37 °C. Mischen Sie alle 5 Minuten durch Klopfen.
   7. Nach der Inkubation 4 ml Medium A hinzufügen und durch Klopfen mischen.
   8. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 178 x g für 3 min.
   9. Nach Entfernen des Überstands fügen Sie 4 ml Medium A hinzu und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer polierten Pasteurpipette.
   10. Filtrieren Sie das verreibte Gewebe mit einem 70 μm porengroßen Netz. Berechnen Sie nach der Filtration die Dichte der Zellen mit einem Hämozytometer.
   11. Kultivieren Sie die Zellen im 8-Well-Kulturobjektträger bei 0,8 x 10⁴ Zellen/Well mit Medium A und halten Sie sie in einem CO₂ -Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 10 % CO₂ bei 37 °C.
   12. Ersetzen Sie das Kulturmedium nach 4 Stunden Kultivierung durch ein Medium, das 2 % Zusatz für die neuronale Kultur, 0,6 % Glukose und 2 mM L-Glutamin (Medium B) enthält.
       Anmerkung: Die Reinheit der Neuronen betrug etwa 75%, wie zuvor beschrieben.
3. Einklappen-Assay
   1. Im Handel gewonnenes Amyloid β1-42 (Aβ1-42) wird in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 0,5 mM aufgelöst und 7 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird die aggregierte Aβ1-42-Lösung bis zur Verwendung in einem Gefrierschrank bei -30 °C gelagert.
      Anmerkung: Diese Inkubation ist für die Aggregation und Toxizität von Aβ notwendig.
   2. Nach 4 Tagen neuronaler Kultur behandeln Sie die Vertiefungen mit 100 μl neuem Medium B, das 0,5 μM aggregiertes Aβ1-42 enthält, oder Vehikellösung (destilliertes Wasser) für 1 h.
      Anmerkung: Die Effekte von Aβ1-42 wurden dosisabhängig von 0,1 auf 5 μM erhöht und erreichten wie zuvor beschrieben einen Spitzenwert von 0,5 μM. Ähnliche Ergebnisse können beobachtet werden, wenn Aβ1-42 nach 3 Tagen neuronaler Kultur 1 h lang behandelt wird.
   3. Entfernen Sie das Kulturmedium und fixieren Sie die Neuronen sofort mit 4 % Paraformaldehyd mit 4 % Saccharose in PBS für 1 h bei 37 °C auf einer Heizplatte.
   4. Waschen Sie die Neuronen nach der Fixierung 3 Mal mit PBS und mounten Sie sie mit einem wässrigen Eindeckmedium. Trocknen Sie das Eindeckmedium 2–4 Tage lang bei 4 °C.
   5. Erfassen Sie den gesamten Bereich (7,8 x 9 mm²) jeder Vertiefung mit einer 20-fachen Trockenobjektivlinse an einem inversen Mikroskop.
   6. Klassifizieren Sie die längsten Neuriten jedes Neurons im Stadium 3 oder 4 als Axone, wie zuvor beschrieben.
   7. Klassifizieren Sie Wachstumszapfen nach folgenden Kriterien: 1) axonale Wachstumszapfen ohne Lamellipodien oder 2) mit weniger als drei Filopodien gelten als kollabierte Wachstumskegel, wie zuvor beschrieben.
      Anmerkung: Gesunde Wachstumszapfen werden mit 0 Punkten bewertet; Eingeklappte Wachstumskegel werden als 1 Punkt gewertet. Für jede Behandlung werden die mittleren Kollapswerte berechnet.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ddY Mäuse	Slc
Kulturobjektträger mit acht Vertiefungen	Falke	354108
Poly-D-Lysin	Wako	Nr. 168-19041
Kulturmedium, Neurobasales Medium	Gibco	Artikel-Nr.: 21103-049
Serum für das Haus	Gibco	Artikel-Nr.: 26050-088
Traubenzucker	Wako	Tel.: 049-31165
L-Glutamin	Wako	Tel.: 074-00522
0,05% Trypsin	Gibco	Artikel-Nr.: 25300-054
DNase I	Worthington	DP
Trypsin-Hemmer für Sojabohnen	Gibco	Tel.: 17075-029
Filter mit 70 μm Maschenweite, Zellsieb	Falke	Artikel-Nr.: 352350
B-27 Zuschlag	Gibco	Artikel-Nr.: 17504-044
CO2 -Inkubator	Astec	SCA-165DS
Amyloid β1-42	Sigma-Aldrich	Nr. A9810
Paraformaldehyd	Wako	Tel.: 162-16065
Saccharose	Wako	Tel.: 196-00015
Wässriges Eindeckmedium, AquaPoly/Mount	Polywissenschaften	Nr. 18606-20
Inverses Mikroskop A	Carl Zeiss	Axio Observer Z1	Verbunden mit AxioCam MRm, Heizeinheit XL S, CO2-Modul S1 und TempModul S1
Objektiv Plan-Apochromat 20x	Carl Zeiss	Artikel-Nr.: 420650-9901