Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung von Gewebeschnitten für die bildgebende Massenspektrometrie (IMS)
- Aufbereitung einer Gewebeprobe eines autopsierten menschlichen Gehirns
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass der Probenvorbereitungsschritt für IMS den ursprünglichen Zustand des Gewebes beibehält. Vermeiden Sie Kontaminationen und postmortale Veränderungen. Der folgende Schritt ist entscheidend.
- Entnahme humaner kortikaler Proben für IMS aus Gehirnen, die innerhalb von 8 Stunden post mortem entnommen, verarbeitet und bei -80 °C gelagert wurden. Entnehmen Sie die Gehirnprobe aus dem okzipitalen Kortex von Alzheimer-Patienten (AD) und altersgleichen Kontrollen.
- Präparation von gefrorenen Gewebeschnitten
- Schneiden Sie die Gewebeschnitte auf einem Kryostaten. Legen Sie leitfähige Indium-Zinnoxid (ITO)-beschichtete Objektträger in den Kryostaten.
- Erwärmen Sie die Autopsie-Hirnprobe im Kryostaten von -80 °C auf -22 °C.
- Befestigen Sie für jedes Experiment eine neue Einwegklinge am Kryostaten. Versuchen Sie immer, einen sauberen Teil der Klinge zu verwenden.
- Legen Sie das gefrorene Autopsiegehirn zusammen mit einer kleinen Menge der Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) auf den Tisch (genug, um den zentralen Bereich des Tisches zu bedecken; siehe Materialtabelle).
- Wählen Sie die Bedingungen für den Dünnschnitt. Verwenden Sie für IMS eine Dicke von 10–12 μm für menschliche Gehirnschnitte. Schneiden Sie für IMS und Immunhistochemie (IHC) fünf bis sechs Schnitte von jeder Gewebeprobe.
- Wenn die Klinge gerade anfängt, das Gewebe zu schneiden, drehen Sie das Rad und "richten" Sie den Block, bis das gesamte Gewebe freigelegt ist. Wenn es einen kleinen Streifen oder Riss in der Sektion gibt, warten Sie noch ein wenig im Kryostaten, bis die Temperaturanpassung ihn automatisch behebt. Zählen Sie einige Sekunden, bevor Sie die Anti-Roll-Funktion mit einem Taschentuch darunter öffnen.
- Legen Sie die Gewebescheibe sofort auf die ITO-beschichtete Seite des Objektträgers. Tauen Sie die Gewebescheibe auf, indem Sie einen Finger unter den Objektträger auf der nicht ITO-beschichteten Seite legen. Das Gewebe klebt an der Rutsche; Stellen Sie sicher, dass das Gewebe so flach wie möglich und ohne Falten ist. Führen Sie diesen Schritt bei Raumtemperatur durch.
Anmerkung: Tragen Sie Handschuhe, Masken und einen Laborkittel, da die menschlichen Proben biologische Verunreinigungen enthalten können. Wenn alle Abschnitte für den Tag erstellt wurden, reinigen Sie den Kryostaten, die Bürsten und die Spannfutter mit Labortüchern und 200 ml 100 % Ethanol.
- Spülen der Gewebeschnitte
- Tauchen Sie die Proben 30 s lang in 40–100 ml 70%iges Ethanol, um endogene Lipide und anorganische Salze zu entfernen. Verwende ein Färbeglas aus Glas.
- Waschen Sie die Proben 30 s lang mit 40–100 ml 100 % Ethanol, 3 ms lang 40–100 ml Carnoy-Lösung, 30 s lang 40–100 ml 100 % Ethanol, 10 min lang 40–100 ml 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) und 30 s lang 40–100 ml 100 % Ethanol. Verwenden Sie ein Färbeglas < />
Anmerkung: Die Carnoy-Lösung ist ein Fixiermittel, das aus sechs Teilen Ethanol, drei Teilen Essigsäure und einem Teil Chloroform besteht.
- 30 min im Vakuum trocknen.
- Behandlung der Gewebeschnitte mit einem Ameisensäuredampf zur besseren Ionisierung der Aβ-Proteine aus Autopsie-Hirngeweben
- Bereiten Sie den Ofen und den Inkubationsglasobjektträger für die anschließende Verdampfung mit 5 mL 100%iger Ameisensäure vor. Um eine zufriedenstellende Säurebehandlung zu erreichen, halten Sie die Luftfeuchtigkeit in der Inkubationsglasschale während dieses Schritts auf Sättigungsniveau und halten Sie die Temperatur bei 60 °C. Legen Sie die Gewebeobjektträger in die Inkubationsglasschale, vermeiden Sie ein Eintauchen in die Ameisensäure und behandeln Sie sie 6 Minuten lang.
- Nehmen Sie ein optisches Bild der Proben mit einem Filmscanner, Gelscanner oder einem Digitalmikroskop usw. auf. Führen Sie diesen Schritt bei Raumtemperatur durch. Die Ausrichtung des optischen Bildes der Proben ist notwendig, wenn das Probentarget im Gerät platziert wird. In der Regel ist es nicht möglich, den Gewebeschnitt unterhalb der Matrixschicht zu erkennen.
HINWEIS: Der bequemste Weg, ein optisches Bild aufzunehmen, ist die Verwendung eines Büroscanners. Es empfiehlt sich, das Bild im Speicherordner für Bilddaten zu speichern.
- Um die optischen Bilder mit den Proben zu korrelieren, machen Sie Hilfsmarkierungen, die sowohl im optischen Bild als auch unter der Matrixschicht in der Kameraoptik sichtbar sind. Am einfachsten ist es, vor der Aufnahme des optischen Bildes mindestens drei Korrekturflüssigkeitsmarkierungen um die Probe herum zu erkennen.
- Matrix-Anwendung
- Herstellung der Matrixlösung
- Bereiten Sie in einem organischen, lösungsmitteltoleranten Mikroröhrchen eine 10 mg/ml Sinapinsäure (SA)-Lösung in 50 % Acetonitril (ACN) und 0,1 % TFA vor. Die SA-Verbindung durch Vortexen oder kurze Beschallung für 10 min gründlich auflösen. Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Es gibt drei verschiedene Optionen für das Matrixsprühen: mit einer Airbrush, einem Ultraschallspritzgerät oder einem automatischen Sprühgerät.
- Sprühen der Matrix mit einer Airbrush
- Führen Sie den Vorgang bei konstanter Raumtemperatur (20–23 °C) und Luftfeuchtigkeit (40 % – 60 %) durch. Zu den Parametern, die für ein optimales Sprühen angepasst werden müssen, gehören die Größe des Tröpfchens, die Nebelmenge, der Winkel und der Abstand zwischen der Sprühdüse und dem Gewebeschnitt sowie die Labortemperatur und -feuchtigkeit. Passen Sie diese Bedingungen an, indem Sie die Mikroskopieergebnisse überprüfen.
Anmerkung: Da zu den limitierenden Faktoren die Kristallgröße und die Homogenität der Matrixabdeckung sowie die unerwünschte Migration/Diffusion von Analyten gehören, ist kleiner besser für die Tropfengröße. Die Homogenität ist auch der Punkt der Inspektion.
- Besprühen der Matrix mit einem Ultraschall-Sprühgerät
- Entfernen Sie das zu sprühende Gewebe aus dem Exsikkator und legen Sie es in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass das Taschentuch das Sensorfenster nicht bedeckt.
- Starten Sie die Vorbereitung, indem Sie die Starttaste drücken; normalerweise beträgt die Vorbereitungszeit etwa 90 Minuten. Die Aufbereitung wird automatisch über die Überwachung der Matrixschichtdicke und der Nässe geregelt. Nachdem die Vorbereitung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Objektträger und bewahren Sie ihn 15 Minuten lang im Exsikkator auf, bevor Sie ihn im MALDI-Gerät ablesen.
- Reinigen Sie das Sprühgerät mit 2–3 mL 100 % Methanol (MeOH), bis der Sprühkopf sauber erscheint.
Anmerkung: Ein feiner Nebel aus Matrixtröpfchen wird durch eine Gravitationsschicht in das Gewebe sinken lassen. Es wird eine durchschnittliche Tröpfchengröße von 20 μm erzeugt; Alle Tröpfchendurchmesser betragen weniger als 50 μm.
- Besprühen der Matrix mit einem automatischen Sprühgerät
- Sprühen Sie die Matrixlösung mit einem automatischen Sprühgerät auf die Gewebeoberfläche. Ein konstanter Strom von erhitztem Mantelgas (N2, eingestellt auf 10 psi und 75 °C) wird zusammen mit dem Matrixlösungsspray abgegeben. Verwenden Sie ein Lösungsmittelpumpensystem (eingestellt auf 10 psi und 0,15 ml/min), um die Matrixlösung zu verabreichen.
Anmerkung: Am wichtigsten ist, dass Sie unter einem Sicherheitsschrank arbeiten, um das Einatmen von Matrixaerosolen zu vermeiden. Steuern Sie die Raumtemperatur und die Luftfeuchtigkeit, um eine homogene Matrixkristallisation zu reproduzieren.
>2. MALDI-IMS
- Führen Sie Ultrahochgeschwindigkeits-Massenspektrometrie durch.
- Führen Sie Bildgebungsexperimente mit hohem Durchsatz und hoher räumlicher Auflösung mit MALDI-IMS durch, das mit einem 10-kHz-Neodym-dotierten Yttrium-Aluminium-Granat-Laser (Nd:YAG, 355 nm) ausgestattet ist.
- Für massenspektrometrische Messungen definieren Sie die Gewebebereiche mit der Steuerungssoftware MALDI und der Datenanalysesoftware.
- Erfassen Sie Spektren in einem positiven linearen Modus mit einem Massenbereich von m/z 2.000–20.000 und einer räumlichen Auflösung von 20 und 100 μm.
- Um den Kalibrierstandard herzustellen, lösen Sie den Peptid-Kalibrierstandard und den Proteinkalibrierstandard im Verhältnis 1:4 mit alpha-Cyano-4-hydroxyl-zimtsäure (CHCA) in TA30-Lösung (ACN: 0,1 % TFA = 30:70) auf und verdünnen Sie ihn dann 10x. Legen Sie 1 μl des Kalibrierstandards an vier verschiedenen Stellen auf den Objektträger.
- Überlagern Sie mit Hilfe von molekularer Histologie-Software (siehe Materialtabelle) mehrere Einzelbilder, um die räumliche Korrelation verschiedener Signale zu finden, z. B. verschiedene Aβ-Peptide, die in senilen Plaques (SPs) und Arterienwänden kolokalisieren.
