Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Materialien
- Vorbereitung der Injektion von Lipopolysaccharid (LPS)
- 25 ml destilliertes Wasser zu 25 mg LPS-Pulver aus Salmonella typhimurium bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml hinzufügen. Lagern Sie die Injektion in einem sterilen Röhrchen bei 4 °C.
Vorsicht: LPS ist giftig.
- Bereiten Sie eine 2%ige Evansblau-Lösung (EB) in normaler 0,9%iger Kochsalzlösung vor, um die EB-Injektion auf Arbeitskonzentration zu halten.
>2. Tiere
Verabreichen Sie LPS an männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten im Alter von 10 Wochen (Durchschnittsgewicht: 280 ± 20 g) durch intraperitoneale Injektion.
Vorsicht: Wenn Ratten von einer anderen Organisation gekauft werden, sollte die Anpassungsphase nicht weniger als 7 Tage betragen.
>3. LPS-Injektionen
- Injizieren Sie jeder Ratte intraperitoneal LPS in einer Dosis von 1 mg/kg und bringen Sie die Ratten in ihren Heimatkäfig zurück.
Anmerkung: Eine Anästhesie ist nicht notwendig.
- Sechs Stunden später injizieren Sie den Ratten die gleiche Dosis LPS-Injektion.
- Sechzehn Stunden später injizieren Sie den Ratten die gleiche Dosis LPS.
Vorsicht: Die Injektion von LPS in einer Dosis von 1 mg/kg an Ratten kann zu einer Mortalitätsrate von 5 % führen. Die Sterblichkeitsrate könnte bei jüngeren oder älteren Ratten oder trächtigen weiblichen Ratten weiter ansteigen.
- Bringen Sie die Ratten nach der LPS-Injektion wieder in ihre Käfige zurück und gewähren Sie ad libitum Zugang zu Futter und Getränken.
Anmerkung: Ratten zeigen eine ausgeprägte systemische Entzündungsreaktion, daher ist es wichtig, dass die Käfige während des gesamten Experiments sauber bleiben. Ratten sollten nach der ersten LPS-Injektion häufig (2x täglich) auf Gewicht, allgemeines Aussehen und Verhalten überwacht werden. Wenn die Ratten beginnen, eine gebeugte Haltung, Bewegungsunwilligkeit, einen signifikanten Gewichtsverlust (>20%) und Porphyrinfärbung zu zeigen, sollten sie vor dem Endpunkt der 7-tägigen EB-Studie human eingeschläfert werden.
>4. Probenentnahme
- EB-Injektion
- Sieben Tage nach der ersten Injektion betäuben Sie die Ratte intraperitoneal gemäß Ihrem genehmigten IACUC-Protokoll.
- Warten Sie 1–2 Minuten, bis die Ratten keine Hornhautreflexreaktionen mehr zeigen. Führen Sie bei jeder Ratte eine 5–8 mm tiefe Herzpunktion durch; Der Punktionspunkt sollte 5 mm am linken Rand des Brustbeins im 3. und 4. Interkostalraum liegen.
- Warten Sie, bis eine Bluterholung beobachtet wurde, und injizieren Sie EB dann in einer Dosis von 0,2 ml/100 g Körpergewicht in den linken Herzventrikel.
Vorsicht: Herzpunktion und EB-Injektion sollten sorgfältig durchgeführt werden. EB kann in die Brusthöhle oder das Perikard anstelle des linken Herzventrikels injiziert werden.
- Saugen Sie mit einem leeren Schlauch zurück und ersetzen Sie dieses Volumen vor der Injektion durch einen EB-Schlauch, um die Ausfallrate zu verringern (z. B. irrtümliche Injektion in den Brustkorb).
- Halten Sie die Ratte 10 Min. lang in Rückenlage
HINWEIS: Wenn die Probe nicht zum Nachweis von EB-Leckagen in der Immunfluoreszenzbildgebung verwendet wird, kann dieser Schritt weggelassen werden.
- Grobe Beobachtung
- Führen Sie Herzperfusionen mit eiskalter 1 M Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) durch, um die zerebralen Gefäße und das Gehirn zu reinigen.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen Bauchschnitt über die gesamte Länge des Zwerchfells.
- Schneiden Sie die Rippen links von der Mittellinie des Brustkorbs durch.
- Öffnen Sie die Brusthöhle. Verwenden Sie Klammern, um das Herz freizulegen und den Abfluss von Blut und anderen Flüssigkeiten zu erleichtern.
- Während Sie das Herz mit einer Zange festhalten (das Herz sollte noch schlagen), führen Sie direkt eine Nadel in den Vorsprung des linken Ventrikels ein, um diesen auf etwa 5 mm zu verlängern. Sichern Sie die Nadel an dieser Position, indem Sie sie in der Nähe des Eintrittspunkts festklemmen.
Vorsicht: Dehnen Sie die Nadel nicht zu stark aus, da sie die Innenwand durchstechen und die Zirkulation der Lösungen beeinträchtigen kann.
- Lassen Sie das Ventil los, um die eiskalte PBS-Lösung (200–300 mL) mit einer langsamen und gleichmäßigen Rate von etwa 20 mL/min mit einer Perfusionspumpe fließen zu lassen. Wenn die Tiere eine Fixierung anstelle einer groben Beobachtung benötigen, verwenden Sie die gleiche Dosis eiskalter 0,9%iger Kochsalzlösung.
- Machen Sie mit einer scharfen Schere einen Schnitt in den Vorhof und stellen Sie sicher, dass die Lösung kontinuierlich fließt. Wenn die Flüssigkeit nicht frei fließt oder aus den Nasenlöchern oder dem Maul des Tieres kommt, positionieren Sie die Nadel neu.
- Screening auf CMHs durch grobe Beobachtung.
Anmerkung: Wird die Stichprobe nicht zur Berechnung der Anzahl der CMH durch Bruttobeobachtung verwendet, so kann dieser Schritt weggelassen werden.
- Fixierung
- Führen Sie Herzperfusionen mit eiskalter 0,9%iger Kochsalzlösung (200–300 ml) durch, um die zerebralen Gefäße und das Gehirn zu reinigen.
- Führen Sie Herzperfusionen mit eiskaltem 4%igem Paraformaldehyd zur Fixierung durch.
- Enthaupten Sie die Ratte, isolieren Sie das Gehirn und tauchen Sie das Gehirn mindestens 6 Stunden lang in 20%ige Saccharoselösung.
- Wechseln Sie die Lösung in 30% Saccharose und fixieren Sie sie für weitere 6 Stunden.
- Bereiten Sie 10 mm dicke Hirngewebeschnitte mit einem Kryostaten vor.
>5. Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung
HINWEIS: Dieses Verfahren wird mit einem HE-Färbekit durchgeführt.
- Waschen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser.
8 - Min. in Hämatoxylinlösung einfärben. 5 Min. unter fließendem Leitungswasser waschen.
- 30 s in 1% saurem Alkohol differenzieren. 1 min unter fließendem Leitungswasser waschen.
- In 0,2%igem Ammoniakwasser (Bluing) oder gesättigter Lithiumcarbonatlösung 30 s bis 1 min einfärben. 5 min unter fließendem Leitungswasser waschen.
- In 95%igem Alkohol (10 Dips) abspülen.
- Mit Eosinlösung 30 s bis 1 min gegenfärben.
- Dehydrieren Sie durch 95% Alkohol, zweimal den absoluten Alkoholgehalt für jeweils 5 Minuten.
- 30 s lang in Xylol klar.
- Montieren Sie mit Lius Methode.
- Analysieren Sie mit einem Hellfeld-Fluoreszenzmikroskop.
Anmerkung: Rote Blutkörperchen, die aus Blutgefäßen freigesetzt werden und die Bestandteile von CMHs sind, erscheinen unter der HE-Färbung in rot-orange.
