$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Primäre Hippocampus-Zellkultur
- Bereiten Sie die dissoziierte Zellkultur des Hippocampus der Ratte am embryonalen Tag 19 vor. Plattieren Sie die Zellen auf 12-mm-Deckgläsern, die mit Polyethylenimin (PEI) beschichtet sind, in 24-Well-Schalen mit einer Dichte von 50.000 - 60.000 Zellen/Well. Überprüfen Sie die Dichte mit einer Zellzählkammer und einer Phasenkontrastoptik.
- Kultivieren Sie die Neuronen 3 Tage lang (Day in vitro (DIV) 3) in einer 24-Well-Platte im Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
- Beurteilen Sie die Deckgläser mit Hilfe der Durchlichtmikroskopie auf Indikatoren für die Zellgesundheit (z. B. Phasenkontrastoptiken mit einer Vergrößerung von 10 - 20X). Achten Sie auf die folgenden Indikatoren für eine gute Gesundheit: einen klaren Phasenkontrast-Halo, Neuriten ohne Wulststrukturen und keine Soma-Clusterbildung oder Neuritenbündelung.
>2. Transfektion
HINWEIS: Das folgende Protokoll bezieht sich auf eine Doppeltransfektion für 3 Vertiefungen. Das Protokoll funktioniert jedoch am besten, wenn Mengen vorbereitet werden, die für 4 Vertiefungen ausreichen.
- 500 ml Transfektionspuffer (274 mM Natriumchlorid, NaCl, 10 mM Kaliumchlorid, KCl, 1,4 mM Dinatriumhydrogenphosphat, Na2 HPO4, 15 mM Glukose, 42mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure, HEPES) in einem Erlenmeyerkolben herstellen.
- 8,0 g NaCl, 0,37 g KCl, 0,095 g Na2 HPO4, 1,35g Glukose und 5,0 g HEPES in 400 ml destilliertem Wasser in einem Erlenmeyerkolben auflösen.
- Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M Natriumhydroxid, NaOH mit einem pH-Messgerät auf 6,95 ein.
- Stellen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 500 mL ein und überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät.
- Machen Sie 20 - 30 mL Aliquots Transfektionspuffer mit den folgenden pH-Werten, indem Sie 1 M NaOH in den Transfektionspuffer pipettieren: 6,96, 6,97, 6,98, 6,99, 7,00, 7,01, 7,02, 7,03, 7,04, 7,05, 7,06, 7,07, 7,08, 7,09, 7,11.
HINWEIS: Der pH-Wert des Transfektionspuffers ist entscheidend für die Wirksamkeit der Transfektion.
- Um zu testen, welcher Transfektionspuffer zu der höchsten Anzahl transfizierter Zellen führt, testen Sie jeden pH-Wert von 6,96 bis 7,11. Es wird die in 2.2 - 2.11 beschriebene Transfektionsmethode und ein validiertes Plasmid verwendet, das grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert. Bestimmen Sie die Anzahl der transfizierten Zellen pro Deckglas für jeden pH-Wert des Transfektionspuffers, um zu beurteilen, welcher Puffer am besten funktioniert.
- Aliquotieren Sie den Puffer mit der höchsten Transfektionseffizienz in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen Frieren Sie die Röhrchen ein und lagern Sie sie bei -20 °C.
- Das reduzierte Serummedium, das Zellkulturmedium und das destillierte Wasser im Wasserbad auf 37 °C vorwärmen.
- Bereiten Sie die Transfektionsmischung in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Arbeiten Sie unter der Laminar-Flow-Haube, um sterile Arbeitsbedingungen zu gewährleisten.
- Mischen Sie 7,5 μl 2 M Calciumchlorid mit je 4 μg endotoxinfreier DNA (Synaptophysin-mOrange und mGFP/GFP-Rogdi). Fügen Sie Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 60 μl in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu erreichen.
- Fügen Sie der Mischung 60 μl Transfektionspuffer hinzu. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, fügen Sie den Transfektionspuffer tropfenweise hinzu, während Sie den DNA-Mix vorsichtig auf dem Vortex schütteln.
- 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Vermeiden Sie ein Schütteln des Inkubationsröhrchens während der Inkubationszeit, indem Sie das Röhrchen neben die Laminar-Flow-Haube stellen.
- Unter der Laminar-Flow-Haube wird das Zellkulturmedium ("konditioniertes Medium") mit einer 1000-μL-Pipette aus den Wells entnommen und in einem separaten Behälter im Inkubator aufbewahrt.
- Geben Sie 500 μl reduziertes Serummedium in jede Vertiefung. Die Zellen werden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bis die 20-minütige Inkubationszeit (Schritt 2.3.3) abgelaufen ist.
- Geben Sie 30 μl Transfektionsmischung in jede Vertiefung, indem Sie mehrere Tropfen pipettieren. Entsorgen Sie die Rückstände am Boden des Röhrchens.
- Nachdem alle Vertiefungen mit der Transfektionsmischung versorgt wurden, schütteln Sie die 24-Well-Platte vorsichtig, um die Verteilung der Transfektionsmischung im Medium sicherzustellen.
- Die Vertiefungen werden 60 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Entfernen und entsorgen Sie die Transfektionsmischung und waschen Sie sie dreimal mit Zellkulturmedium. Geben Sie 1 ml Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 Sekunden lang bei RT. Entfernen Sie 750 μl Medium und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie dies dreimal.
HINWEIS: Der Waschschritt ist entscheidend. Halten Sie die Zeit, in der jede Vertiefung kein Medium enthält, auf ein Minimum (d. h. nehmen Sie sie nach und nach wieder auf) und fügen Sie das Waschmedium vorsichtig hinzu.
- Entfernen und verwerfen Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 450 μl des konditionierten Mediums Well-by-Well hinzu.
- Lassen Sie die Neuronen im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 zu DIV 10 reifen.
>3. Stimulation und Syt1-Aufnahme
HINWEIS: Das folgende Protokoll wendet die Aufnahme auf 3 Vertiefungen an. Für die Depolarisation einer beliebigen anderen Anzahl von Wells passen Sie die Mengen entsprechend an.
- 50 mL 10x Depolarisationspuffer (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM Magnesiumchlorid, MgCl2, 20 mM Calciumchlorid, CaCl2, 300 mM Glucose, 200 mM HEPES, pH 7,4) in einem Erlenmeyerkolben herstellen.
HINWEIS: Der Depolarisationspuffer kann mehrere Wochen lang bei 4 °C gehalten werden. Wenn zusätzlich eine nicht-depolarisierende Lösung verwendet wird, ist eine 10x Tyrode-Lösung bestehend aus 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glucose, 200 mM HEPES pH 7,4 herzustellen, um das stimulationsinduzierte Recycling mit dem spontanen Recycling zu vergleichen. Nach der Verdünnung auf 1x vor Gebrauch 1 μM Tetrodotoxin zugeben, um die Erzeugung eines Aktionspotenzials zu blockieren.
- 1,87 g NaCl, 2,61 g KCl, 0,1 g MgCl2-6H 2O, 0,15 g CaCl 2-2H2O und 3,0 g Glucose-1 H2O und 2,38 g HEPES in 50 ml destilliertem Wasser in einem Erlenmeyerkolben lösen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH ein und filtern Sie die Lösung steril. Verdünnen Sie den Puffer 1:10 in destilliertem Wasser, um eine 1-fache Konzentration zu erreichen.
- Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) für die Fixierung nach der Stimulation vor.
- Für 500 mL 4% PFA in 1x PBS werden 20 g Paraformaldehyd in 450 mL destilliertem H2O gelöst.
HINWEIS: Das Erhitzen der Lösung kann das Auflösen beschleunigen, aber erhitzen Sie die Lösung nicht über 70 °C, da das PFA zerfallen kann.
Vorsicht: PFA ist giftig, potenziell krebserregend und teratogen. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit PFA arbeiten, arbeiten Sie unter dem Abzug und vermeiden Sie Verschlucken.
- Lassen Sie die Lösung auf RT abkühlen und fügen Sie 50 mL 10x PBS-Stammlösung hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH/HCl (Salzsäure) mit einem pH-Messgerät auf 7,4 ein.
- 600 μl 1x Depolarisationspuffer und 10 mL Zellkulturmedium im Wasserbad auf 37 °C vorwärmen.
- 1 μl Maus-Anti-Syt1-Antikörper (Klon 604.2) in den 1x Depolarisationspuffer geben und 10 Sekunden lang vortexen.
- Entfernen und entsorgen Sie das Zellkulturmedium aus den Zellen. 200 μl des Depolarisations-Antikörper-Mixes in jede Vertiefung geben und 5 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 im Inkubator inkubieren.
- Entnehmen und entsorgen Sie den Depolarisations-Antikörper-Mix und waschen Sie ihn dreimal mit Zellkulturmedium. Geben Sie 1 ml Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Sekunden lang bei RT. Entfernen Sie 750 μl Medium und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie dies dreimal.
- Entfernen und verwerfen Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 300 μl 4% PFA in 1x PBS hinzu. 20 Minuten bei 4 °C inkubieren.
- Dreimal für je 5 Minuten mit 1x PBS waschen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
>4. Immunzytochemie
- Bereiten Sie 50 ml Blockierungspuffer vor.
HINWEIS: Der Blockierungspuffer kann mehrere Monate lang bei -20 °C aufbewahrt werden.
- 2,5 g Saccharose und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) in 5 ml 10x PBS-Stammlösung auflösen. Fügen Sie 1,5 ml 10%ige Waschmittel-Stammlösung hinzu. Rühren Sie die Lösung, bis sich alle Bestandteile richtig aufgelöst haben, und fügen Sie destilliertes H2O hinzu, bis ein Endvolumen von 50 ml erreicht ist. Aliquotieren Sie die Lösung und frieren Sie die Aliquote zur Lagerung ein.
- Verdünnen Sie den sekundären, Fluorophor-gekoppelten Antikörper (gerichtet gegen die primäre Syt1-Antikörperspezies) in 200 μl Blockierungspuffer in jeder Vertiefung bei einer Verdünnung von 1:1000.
- Entfernen und entsorgen Sie das 1x PBS aus jeder Vertiefung, die ein Deckglas enthält.
- Geben Sie 200 μl Blockierungspuffer-Antikörper-Mix in jede Vertiefung und inkubieren Sie 60 Minuten lang bei RT.
Vorsicht: Da die Sekundärantikörper lichtempfindlich sind, müssen alle Schritte im Dunkeln durchgeführt werden.
- Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal für 5 Minuten mit 1 mL 1x PBS.
- Betten Sie die Deckgläser mit dem Einbettmedium auf Objektträger ein.
- Geben Sie einen 7-μl-Tropfen Einbettungsmedium auf den Objektträger. Entfernen Sie das Deckglas von der 24-Well-Platte, indem Sie es mit einer Spritze anheben und mit einer Pinzette greifen.
Vorsicht: Zellen auf der Oberfläche des Deckglases können leicht beschädigt werden, daher muss die Pinzette mit Vorsicht behandelt werden.
- Tauchen Sie das Deckglas in destilliertes Wasser, um das PBS zu entfernen, und trocknen Sie es vorsichtig, indem Sie eine Kante mit dem weichen Gewebe berühren.
- Drehen Sie das Deckglas auf das Tröpfchen des Einbettmediums, so dass die Oberfläche, die die Zellen trägt, dem Objektträger zugewandt ist, wodurch die Zellen in das Einbettungsmedium eingebettet werden.
Lassen - Sie die Objektträger 1 - 2 h unter der Haube trocknen (decken Sie sie ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden) und lagern Sie sie in einer Objektträgerbox bei 4 °C.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.