>1. Behandlung von Neuronen
Hinweis: Die Behandlung wurde in der Abteilung (DIV) 7 durchgeführt. Alle Schritte werden unter einer Zellkulturhaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Ein Beispiel für die kortikale neuronale Kulturdichte bei DIV 7 ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Pool-Mikrosomen-assoziierte αS-Aggregate, die aus dem Rückenmark von drei verschiedenen erkrankten transgenen Mäusen gewonnen wurden, um eine 1 μg/μl-Lösung zu erhalten, unter Verwendung des ursprünglichen Homogenisierungspuffers [bestehend aus 250 mM Saccharose, 20 mM HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethenesulfonsäure), 10 mM KCl (Kaliumchlorid), 1,5 mM MgCl2 ((Magnesiumchlorid), 2 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), und 1x Phosphatase/Protease-Hemmer] für die Verdünnung.
- Nehmen Sie eine Neuronenkultur auf Poly-D-Lysin-Deckgläsern in 24-Well-Platten, die Medium (2% B27, 10x Gentamicin und 2 mM Glutamin) enthalten. Entfernen Sie 1/3 des Mediums und ersetzen Sie es vorsichtig durch das frische Medium, das 2% B27, 1x Gentamicin und 2 mM Glutamin enthält.
- Geben Sie 1 μg gepoolte Mikrosomen-assoziierte Alpha-Synuclein (αS)-Aggregate in das Zellmedium. Bringen Sie die Neuronen bei 37 °C in den Inkubator zurück.
- 1 Woche lang alle 3 Tage 1/3 frisches Medium hinzufügen. Tauschen Sie das Medium nicht aus. Fügen Sie es einfach hinzu.
- Entfernen Sie nach 1 Woche Behandlung 1/3 des Mediums und ersetzen Sie es vorsichtig durch das frische Medium, das 2 % B27, 10 μg/ml Gentamicin und 2 mM Glutamin enthält. Wiederholen Sie dies alle 3 Tage.
- Fixieren Sie Neuronen nach 2-wöchiger Behandlung (DIV 21).
2. Immunfluoreszenz
- Fixieren Sie Neuronen mit 2 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 1x und 5 % Saccharose für 15 min bei Raumtemperatur (RT), ohne unter einem chemischen Abzug zu schütteln.
- Entfernen Sie die Befestigungslösung. Kurz mit PBS 1x 3 Mal waschen.
Anmerkung: Führen Sie alle Waschschritte vorsichtig durch, da die primären Neuronen nicht fest an den Polylysin-Deckgläsern haften.
- Permeabilisieren Sie Neuronen mit 0,3% nichtionischem Tensid in PBS 1x für 5 min bei RT.
- 1x, 3 Mal kurz mit PBS waschen.
- Inkubieren Sie Neuronen mit 3% fetalem Rinderserum (FBS) in PBS 1x für 30 min bei RT, um unspezifische Bindungsstellen auf einem orbitalen Shaker zu blockieren.
- Inkubieren Sie Neuronen mit geeigneten Primärantikörpern, die in 3 % FBS in PBS 1x, O/N bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler gelöst sind.
HINWEIS: Es wurden syn303 (1:1.000), Maus αS (1:200), pser129-αS (1:1.000) und Tau (1:10.000) Antikörper verwendet.
- Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie kurz 1x 3 Mal mit PBS.
- Neuronen mit geeigneten fluoreszierenden Sekundärantikörpern, gelöst in 3% FBS in PBS, für 1 h bei RT im Dunkeln auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
- Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie kurz 1x 3 Mal mit PBS.
- Färben Sie Neuronen mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol)-Lösung (0,1 μg/mL in PBS 1x) für 15 min bei RT im Dunkeln auf einem Orbitalschüttler.
- Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie sie kurz 1x 3 Mal mit PBS.
- Montieren Sie Deckgläser mit einem Antifa-Montagemedium auf einem Objektträger.
