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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
1. Tiere
- Bewahren Sie den Stamm TgBAC (gfap:gfap-GFP) Zebrafisch 167 (AB) im Alter zwischen 6 und 9 Monaten unter Standardbedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 °C und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14/10 Stunden auf.
>2. Reversible systemische Anästhesie
- Bereiten Sie die Stammlösung aus Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz (Tricain) vor, indem Sie 400 mg Tricainpulver in 97,9 ml Aquarienwasser und 2,1 ml 1 M gepufferte Tris-Kochsalzlösung (TBS) auflösen. Mit 1 M Tris (pH 9) auf pH 7,0 einstellen und bei 4 °C im Dunkeln bis zu einem Monat lagern.
Anmerkung: Tricain sollte in Wasser zubereitet werden, das den natürlichen Lebensbedingungen des Tieres entspricht, vorzugsweise sollte originales Aquarienwasser verwendet werden.
- Verdünnen Sie die Stammlösung in Aquarienwasser auf 1:25 und verwenden Sie sie sofort.
- Legen Sie den Zebrafisch in eine 10 cm große Petrischale mit 50 ml Anästhesielösung, bis er unbeweglich wird und nicht mehr auf äußere Reize reagiert (ca. 2 - 5 Minuten, je nach Gewicht und Alter).
- Übertragen Sie jeden Fisch von Hand in einen speziell angefertigten Silikonstifthalter für die Laserbehandlung (Abbildung 1A).
Vorsicht! Die Fische können außerhalb des Tanks nur bis zu 10 Minuten betäubt bleiben.
- Um die Anästhesie nach der Behandlung und/oder Bildgebung rückgängig zu machen, legen Sie den Zebrafisch in einen Behälter mit Aquarienwasser.
- Um die Genesung zu unterstützen, erzeugen Sie einen Fluss von frischem Aquarienwasser über die Kiemen, indem Sie den Zebrafisch im Wasser hin und her bewegen.
>3. Laserfokale Verletzung der Netzhaut
HINWEIS: Ein 532 nm Diodenlaser wird verwendet, um fokale Lichtschäden auf der Netzhaut des Zebrafisches zu erzeugen. Der experimentelle Aufbau des Lasers ermöglicht die Etablierung einer reproduzierbaren fokalen Netzhautverletzung bei adulten Zebrafischen.
- Ausgangsleistung des Lasers einstellen: 70 mW; Antennendurchmesser: 50 μm; Pulsdauer: 100 ms.
Vorsicht! Der Einsatz von Laserlicht erfordert einen entsprechenden persönlichen Schutz und eine Kennzeichnung des Bereichs.
- Tragen Sie vor der Behandlung 1 - 2 Tropfen 2%ige Hydroxypropylmethylcellulose topisch auf das Auge auf und fokussieren Sie den Laserstrahl mit einer 2,0 mm Fundus-Laserlinse auf die Netzhaut.
Vorsicht! Hydroxypropylmethylcellulose-Tropfen sind zähflüssig und können Atemprobleme verursachen, wenn sie auf die Kiemen gelangen.
- Platzieren Sie vier Laserspots um den Sehnerv am linken Auge und verwenden Sie das rechte, unbehandelte Auge als interne Steuerung.
