Messung der Aktivierung von Geruchsrezeptoren mit einem zyklischen Echtzeit-Adenosinmonophosphat-Assay

Zusammenfassung

Quelle: Zhang, Y. et al., Lebendzellmessung der Odorantrezeptoraktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay. J. vis. exp.(2017)

Dieses Video demonstriert das Protokoll zur Messung der Odorantrezeptoraktivierung in transfizierten Zellen mit einem zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensor und Lumineszenzdetektion. Die Methode wird angewendet, um Rezeptor-Liganden-Interaktionen und Signalwege in olfaktorischen Neuronen zu untersuchen.

Protokoll

>1. Stimulation und Messung der Aktivität von Geruchsrezeptoren (OR) mit dem Echtzeit-cAMP-Assay

1. Beobachten Sie die transfizierten Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop, um eine korrekte Konfluenz von 50-80 % pro Vertiefung zu gewährleisten, und kehren Sie zum Inkubator zurück.
2. Bereiten Sie das Stimulationsmedium vor, indem Sie 10 mM Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure (HEPES) und 5 mM Glukose zu Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) hinzufügen.
3. Tauen Sie die Aliquote des Substrats des Echtzeit-cAMP-Assays auf Eis auf. Lagern Sie das Substratreagenz bei -80 °C bei 55 μl pro Gefäß in Polymerase-Kettenreaktions-Röhrchen (PCR). Verwenden Sie 1 Tube pro Platte.
4. Bereiten Sie eine 2%ige Äquilibrierungslösung vor, indem Sie 55 μl des Substratreagenzes und 2750 μL HBSS/HEPES/Glukoselösung mischen.
5. Verteilen Sie eine dicke Schicht Papiertücher auf der Bank. Klopfen Sie die Platte vorsichtig und wiederholt mit dem Kopf nach unten auf das Papiertuch, so dass das Transfektionsmedium vollständig von ihm absorbiert wird.
6. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 50 μl HBSS/HEPES/Glukoselösung in jede Vertiefung pipettieren.
7. Klopfen Sie die HBSS/HEPES/Glukoselösung vorsichtig und wiederholt aus der 96-Well-Platte aus.
8. Pipettieren Sie 25 μl 2%ige Äquilibrierungslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie 2 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
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9. M Odorstoff-Stammlösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) vorbereiten und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
10. Vor Ablauf der Inkubationszeit verdünnen Sie die Odorierstoff-Stammlösungen auf Arbeitskonzentrationen im HBSS/HEPES/Glukose-Stimulationsmedium.
    Anmerkung: Die Konzentrationen der in diesem Schritt hergestellten Odoriermittelverdünnungen sollten verdoppelt werden, um die korrekten Endkonzentrationen in jeder Vertiefung zu erhalten.
11. Messen Sie mit einem Chemilumineszenzplatten-Reader und vor der Zugabe von Odoriermittel den basalen Lumineszenzgrad der Platte 2 Mal hintereinander mit einer Rate von 1000 ms pro Well.
12. Nehmen Sie die Platte schnell aus dem Plattenleser, fügen Sie 25 μl Odoriermittelverdünnungen zu jeder Vertiefung hinzu und beginnen Sie sofort mit der kontinuierlichen Lumineszenzmessung aller Vertiefungen für 20 Zyklen innerhalb von 30 Minuten
    Anmerkung: Pipettieren Sie vorsichtig, um eine Kontamination benachbarter Vertiefungen zu vermeiden, wenn unterschiedliche Geruchsstoffe und/oder unterschiedliche Konzentrationen derselben Geruchsstoffe in derselben Platte verwendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dmso	Sigma	Nr. D2650
GloSensor cAMP Reagenz	Promega	Nr. E1290
HBSS, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid	GIBCO	14175095
HEPES	Hyklon	SH30237
Muscone	Santa Cruz	SC-200528
Moschus-Tibet	Sigma-Aldrich	S359165
PBS, ohne Calcium oder Magnesium	Cellgro	21-040-CV
0,2-ml-PCR-Röhrchen	Axygen	PCR-02-C
1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen	Eppendorf
15 mL konisches Röhrchen 17 mm x 120 mm	BD Falke	352096
8-Well- und/oder 12-Well-Mehrkanalpipettierer	Eppendorf
96-Well-Platte mit flachem Boden für weiße Zellkulturen	Greiner	655098
100 mm x 20 mm Zellkulturschale	BD Falke	353003
Unendlicher F200 Plattenleser	Tecan