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Charakterisierung des extrazellulären Raums in einem Hirnschnitt mit ionenselektiven und Iontophorese-Mikroelektroden

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

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Quelle: Odackal, J., et al. Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung des Volumenanteils und der Tortuosität des extrazellulären Raums des Gehirns. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt, wie man den extrazellulären Raum in einem Gehirnschnitt charakterisiert, indem ionenselektive und Iontophorese-Mikroelektroden verwendet werden, um elektrische Signale zu messen und zu vergleichen. Dieser Prozess hilft bei der Bestimmung des Volumenanteils und des Verdrillungsgrades des Raums.

Protocol

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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

>1. Echtzeit-Iontophorese in Hirnschnitten

  1. Legen Sie eine 400 μm dicke Hirnscheibe in die Aufnahmekammer und stellen Sie sicher, dass sie vollständig in die fließende künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) eingetaucht ist. Positionieren Sie die Scheibe mit einem Aquarellpinsel und befestigen Sie sie vorsichtig mit einem Gitter.
  2. Bewegen Sie sowohl die Iontophorese-Mikroelektrode als auch das ISM über das Interessenfeld auf dem Hirnschnitt. Tauchen Sie sowohl in das fließende ACSF al....

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Disclosures

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Verstärker für ISMDaganModell IX2-700 Dualer intrazellulärer VorverstärkerIonen- und Referenzspannungsverstärker mit N=0,1 (für Referenzfederhaus) und N=0,001 (für Ionenrohr) Kopfstufen
Biologisches Compound Miscroscope (mit 4x und 10x Objektiv)zum Chippen der Mikroelektrodenspitzen und zur Inspektion von Mikroelektroden; verschiedene Anbieter, z.B. AmScope
Borosilikat-Theta-KapillarglasröhreHarvard-ApparaturWarner Instruments Modell TG200-4; Bestellnummer #64-0811doppelläufige Glasröhren für ionenselektive Mikroelektroden und iontophoretische Mikroelektroden; AD 2,0 mm, I.D. 1,4 mm, Septum 0,2 mm, Länge 10 cm
Diagrammschreiberzur kontinuierlichen Aufzeichnung von Spannungen an der ionenselektiven Mikroelektrode während der Kalibrierung in Tetramethylammonium-Standards und während des RTI-Experiments; z.B. Kipp & Zonen Typ BD112 Doppelkanalkarte aufgezeichnet, verfügbar refurbished
Kommerzielle SoftwareDie MathWorksMATLAB, Toolbox zur Datenerfassungzur Datenerfassung und -analyse mit den Programmen Wanda und Walter. Beachten Sie, dass eine akademische Lizenz verfügbar ist.
AugenschutzbrilleFischer
Verbundmikroskop mit festem TischOlympBX51WIKann andere Verbundmikroskope mit festen Tischen verwenden
ZangeWerkzeuge für die Feinwissenschaft#11251-10zum Absplittern der Glaskapillare; Dumond #5, bevorzugt gebraucht und für feine Arbeiten nicht mehr benötigt
iontophoretische EinheitDaganION-100 und PS-100ION-100 ist eine Einkanal-Iontophoreseeinheit mit +/- 130 V Konformität; PS-100 ist ein externes Netzteil; Alternativen: z.B. Axoprobe-1A von Axon Instruments (jetzt Molecular Devices), nicht mehr in Produktion, Prüfung auf Verfügbarkeit von generalüberholten Geräten (eBay und andere Websites)
Mikroelektroden-HalterWPIM3301EHzum Halten von ionenselektivem Mikroeletrodvorgefertigtem für die Silanisierung und zum Befüllen der Spitze des ionenselektiven Zylinders mit flüssigem Ionenaustauscher; WPI verkauft zwei Versionen dieses Halters, klares M3301EH und schwarzes M3301EH. Unserer Erfahrung nach scheint das klare M3301EH stabiler zu sein als das schwarze M3301EH.
MikromanipulatorNarishigeMM-3zur Positionierung der ionenselektiven Mikroelektrode, die während der Silanisierung vorgefertigt wird und die Spitze des ionenselektiven Zylinders mit dem flüssigen Ionenaustauscher gefüllt wird; kann durch einen beliebigen dreiachsigen Mikromanipulator in gutem Betriebszustand ersetzt werden
Objektiv 5x trockenOlympMPlan N
Objektiv 10x Eintauchen in WasserOlympUMPlan FL NDas 10-fache Objektiv ist Wasserimmersion, die numerische Apertur beträgt 0,3, der Arbeitsabstand beträgt 3,3 mm
Plattform und X-Y-Translationstisch für Mikroskope mit festem TischEXFOGibraltar BurleighDie Plattform nimmt die Schichtkammer, Mikromanipulatoren und Zubehör auf, der X-Y-Translationstisch bewegt das Mikroskop, ohne die Aufnahmestabilität zu beeinträchtigen
Roboter-Mikromanipulator mit präziser X,Y,Z-PositionierungSutter InstrumenteMP-285Es werden zwei Mikrominipulatoren benötigt, um die ionenselektive Mikroelektrode und die iontophoretische Mikroelektrode getrennt zu halten. Es ist auch möglich, Mikropipetten in einem beabstandeten Array zu kleben (siehe Text).
Signalaufbereitungsgerät mit TiefpassfilterAxon InstrumenteCyberAmp 320 oder 380Hersteller nicht mehr erhältlich, ggf. aber bei E-Bay erhältlich; Alternativen: z.B. FLA-01 Filter/Verstärker von Cygnus Technology. Dabei handelt es sich um ein Einkanal-Instrument mit einer minimalen Grenzfrequenz von 10 Hz unter Verwendung eines mehrpoligen Bessel-Filters, aber das Unternehmen ist möglicherweise bereit, es bei Bedarf für eine niedrigere Grenzfrequenz (2 Hz) zu modifizieren.
SilberdrahtA-M Systeme#7830Durchmesser 0,015", blank (keine Beschichtung)
Scheiben-KammerHarvard-ApparaturWarner Modell RC-27LDies ist die Submersion Slice Chamber; verwenden Sie keine Interface-Slice Chamber
stereomikroskopzur Silanisierung und Befüllung der Spitze des ionenselektiven Zylinders mit flüssigem Ionenaustauscher; horizontal montiert; verschiedene Anbieter
Tetramethyammonium (TMA)-chloridSigma-AldrichT-34115 M Lösung; VORSICHT: akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ), Karzinogenität, gefährlich für die aquatische Umwelt, siehe Sigma-Aldrich Sicherheitsinformationen für eine vollständige Beschreibung
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Extracellular SpaceBrain SliceIon Selective MicroelectrodeIontophoresis MicroelectrodeTetramethylammoniumVolume FractionTortuosityArtificial Cerebrospinal FluidDual Channel ElectrodeSignal Recording

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