Charakterisierung des extrazellulären Raums in einem Hirnschnitt mit ionenselektiven und Iontophorese-Mikroelektroden

Zusammenfassung

Quelle: Odackal, J., et al. Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung des Volumenanteils und der Tortuosität des extrazellulären Raums des Gehirns. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt, wie man den extrazellulären Raum in einem Gehirnschnitt charakterisiert, indem ionenselektive und Iontophorese-Mikroelektroden verwendet werden, um elektrische Signale zu messen und zu vergleichen. Dieser Prozess hilft bei der Bestimmung des Volumenanteils und des Verdrillungsgrades des Raums.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

>1. Echtzeit-Iontophorese in Hirnschnitten

1. Legen Sie eine 400 μm dicke Hirnscheibe in die Aufnahmekammer und stellen Sie sicher, dass sie vollständig in die fließende künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) eingetaucht ist. Positionieren Sie die Scheibe mit einem Aquarellpinsel und befestigen Sie sie vorsichtig mit einem Gitter.
2. Bewegen Sie sowohl die Iontophorese-Mikroelektrode als auch das ISM über das Interessenfeld auf dem Hirnschnitt. Tauchen Sie sowohl in das fließende ACSF als auch über die Scheibe ein.
3. Versetzen Sie die Spannung sowohl für den Referenz- als auch für den Ionensensorkanal auf "0" mV. Warten Sie, bis sich die Spannung in beiden Kanälen stabilisiert hat. Markieren Sie auf dem Diagrammschreiber die Spannung, die am Ionenmesskanal des ISM gemessen wurde. Verwenden Sie diese Option, um den Basisparameter V in Wanda zu berechnen.
4. Platzieren Sie die ISM- und die Iontophorese-Mikroelektrode 200 μm tief in der Scheibe und 120 μm voneinander entfernt. Warten Sie, bis sich das Signal stabilisiert hat, nachdem Sie die Mikroelektrode in die Hirnscheibe bewegt haben.
   Anmerkung: Der an die Iontophorese-Mikroelektrode angelegte Vorspannungsstrom bewirkt eine geringe Akkumulation von Tetramethylammonium (TMA). Es ist ein häufiger Fehler, eine Aufnahme zu früh zu machen und den Signalaufbau zu unterschätzen.
5. Markieren Sie auf dem Diagrammschreiber die stabilisierte Spannung, die in der Gehirnscheibe auf dem Ionensensorkanal des ISM gemessen wurde. Berechnen Sie die Spannungsdifferenz zwischen dem in Schritt 8.3 und Schritt 8.4 gemessenen TMA-Signal und geben Sie diesen Wert in das Feld "Baseline V (mV)" in der Messelektrodenbox der Wanda-GUI ein.
6. Stellen Sie auf der linken Seite der GUI sicher, dass alle experimentellen Parameter korrekt aufgezeichnet/eingegeben wurden. Stellen Sie "Mittel" auf "Gehirn", "Transportzahl" auf den Mittelwert, der in Schritt 7.4 für die Iontophorese-Mikroelektrode berechnet wurde, und "Temperatur" auf die Temperatur des Bads, das die Scheibe enthält.
   HINWEIS: V muss für jeden Messsatz aufgezeichnet werden. Die Baseline V wird von Wanda in den Baseline C (mM) Parameter (d.h. die Konzentration von TMA im Hirngewebe) umgewandelt.
7. Starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf "Erwerben" klicken und erlauben Sie ihr, eine vollständige Aufnahme zu machen. Warten Sie, bis das TMA-Signal zur Grundlinie zurückkehrt, bevor Sie eine neue Aufnahme aufnehmen.
8. Machen Sie zwei bis drei aufeinanderfolgende Aufnahmen, bevor Sie die Mikroelektroden von der gewählten Gehirnstelle entfernen. Geben Sie die gemessene Temperatur unmittelbar vor jeder Aufnahme in die Wanda-Software ein.
9. Bewegen Sie beide Mikroelektroden diagonal zurück zur Oberfläche der Scheibe. Heben Sie beide auf mindestens 50 μm über die Scheibe. Ermitteln Sie mit dem Diagrammschreiber jede Änderung zwischen dem jetzt gemessenen V und seiner Messung aus Schritt 8.3.
10. Zentrieren Sie die Spitzen des ISM und der iontophoretischen Mikroelektroden relativ zueinander in der x-, y- und z-Achse. Ermitteln Sie ggf. Abstandsänderungen über das Display des Steuerkastens des Mikromanipulators.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Verstärker für ISM	Dagan	Modell IX2-700 Dualer intrazellulärer Vorverstärker	Ionen- und Referenzspannungsverstärker mit N=0,1 (für Referenzfederhaus) und N=0,001 (für Ionenrohr) Kopfstufen
Biologisches Compound Miscroscope (mit 4x und 10x Objektiv)			zum Chippen der Mikroelektrodenspitzen und zur Inspektion von Mikroelektroden; verschiedene Anbieter, z.B. AmScope
Borosilikat-Theta-Kapillarglasröhre	Harvard-Apparatur	Warner Instruments Modell TG200-4; Bestellnummer #64-0811	doppelläufige Glasröhren für ionenselektive Mikroelektroden und iontophoretische Mikroelektroden; AD 2,0 mm, I.D. 1,4 mm, Septum 0,2 mm, Länge 10 cm
Diagrammschreiber			zur kontinuierlichen Aufzeichnung von Spannungen an der ionenselektiven Mikroelektrode während der Kalibrierung in Tetramethylammonium-Standards und während des RTI-Experiments; z.B. Kipp & Zonen Typ BD112 Doppelkanalkarte aufgezeichnet, verfügbar refurbished
Kommerzielle Software	Die MathWorks	MATLAB, Toolbox zur Datenerfassung	zur Datenerfassung und -analyse mit den Programmen Wanda und Walter. Beachten Sie, dass eine akademische Lizenz verfügbar ist.
Augenschutzbrille	Fischer
Verbundmikroskop mit festem Tisch	Olymp	BX51WI	Kann andere Verbundmikroskope mit festen Tischen verwenden
Zange	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	#11251-10	zum Absplittern der Glaskapillare; Dumond #5, bevorzugt gebraucht und für feine Arbeiten nicht mehr benötigt
iontophoretische Einheit	Dagan	ION-100 und PS-100	ION-100 ist eine Einkanal-Iontophoreseeinheit mit +/- 130 V Konformität; PS-100 ist ein externes Netzteil; Alternativen: z.B. Axoprobe-1A von Axon Instruments (jetzt Molecular Devices), nicht mehr in Produktion, Prüfung auf Verfügbarkeit von generalüberholten Geräten (eBay und andere Websites)
Mikroelektroden-Halter	WPI	M3301EH	zum Halten von ionenselektivem Mikroeletrodvorgefertigtem für die Silanisierung und zum Befüllen der Spitze des ionenselektiven Zylinders mit flüssigem Ionenaustauscher; WPI verkauft zwei Versionen dieses Halters, klares M3301EH und schwarzes M3301EH. Unserer Erfahrung nach scheint das klare M3301EH stabiler zu sein als das schwarze M3301EH.
Mikromanipulator	Narishige	MM-3	zur Positionierung der ionenselektiven Mikroelektrode, die während der Silanisierung vorgefertigt wird und die Spitze des ionenselektiven Zylinders mit dem flüssigen Ionenaustauscher gefüllt wird; kann durch einen beliebigen dreiachsigen Mikromanipulator in gutem Betriebszustand ersetzt werden
Objektiv 5x trocken	Olymp	MPlan N
Objektiv 10x Eintauchen in Wasser	Olymp	UMPlan FL N	Das 10-fache Objektiv ist Wasserimmersion, die numerische Apertur beträgt 0,3, der Arbeitsabstand beträgt 3,3 mm
Plattform und X-Y-Translationstisch für Mikroskope mit festem Tisch	EXFO	Gibraltar Burleigh	Die Plattform nimmt die Schichtkammer, Mikromanipulatoren und Zubehör auf, der X-Y-Translationstisch bewegt das Mikroskop, ohne die Aufnahmestabilität zu beeinträchtigen
Roboter-Mikromanipulator mit präziser X,Y,Z-Positionierung	Sutter Instrumente	MP-285	Es werden zwei Mikrominipulatoren benötigt, um die ionenselektive Mikroelektrode und die iontophoretische Mikroelektrode getrennt zu halten. Es ist auch möglich, Mikropipetten in einem beabstandeten Array zu kleben (siehe Text).
Signalaufbereitungsgerät mit Tiefpassfilter	Axon Instrumente	CyberAmp 320 oder 380	Hersteller nicht mehr erhältlich, ggf. aber bei E-Bay erhältlich; Alternativen: z.B. FLA-01 Filter/Verstärker von Cygnus Technology. Dabei handelt es sich um ein Einkanal-Instrument mit einer minimalen Grenzfrequenz von 10 Hz unter Verwendung eines mehrpoligen Bessel-Filters, aber das Unternehmen ist möglicherweise bereit, es bei Bedarf für eine niedrigere Grenzfrequenz (2 Hz) zu modifizieren.
Silberdraht	A-M Systeme	#7830	Durchmesser 0,015", blank (keine Beschichtung)
Scheiben-Kammer	Harvard-Apparatur	Warner Modell RC-27L	Dies ist die Submersion Slice Chamber; verwenden Sie keine Interface-Slice Chamber
stereomikroskop			zur Silanisierung und Befüllung der Spitze des ionenselektiven Zylinders mit flüssigem Ionenaustauscher; horizontal montiert; verschiedene Anbieter
Tetramethyammonium (TMA)-chlorid	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M Lösung; VORSICHT: akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ), Karzinogenität, gefährlich für die aquatische Umwelt, siehe Sigma-Aldrich Sicherheitsinformationen für eine vollständige Beschreibung

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