Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Lösungs- und Medienvorbereitung
- Bereiten Sie Stamm- und Pufferlösungen gemäß Tabelle 1 vor. Bereiten Sie Arbeitslösungen gemäß Tabelle 2 vor.
>2. Kultivierung und Erhaltung von F9 RARE-LacZ-Zellen
- Auftauen von gefrorenen Zellen
- Bereiten Sie F9 RARE-LacZ Zellkulturmedium vor, wie in Tabelle 2 beschrieben.
- 10 cm lange Kulturschalen (mit Zellkulturen behandelt) mit 10 ml 0,2 % Gelatine (siehe Tabelle 2) für 30 min bei RT bestreichen. Überschüssige Gelatine mit zwei Spülgängen mit 10 ml destilliertem Wasser abwaschen. Sofort 9 ml F9 RARE-LacZ Zellkulturmedium in den Kolben geben, um ein Austrocknen der Gelatine zu verhindern.
- Ein Fläschchen mit F9 RARE-LacZ-Zellen in einem 37 °C heißen Wasserbad für 2 - 3 min. Auftauen Sie die Plattenzellen (ca. 1 x 106 Zellen/ml) in die beschichtete Schale mit 9 ml Kulturmedium auf. Kultur bei 37 °C, 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag.
- Wartung von F9 RARE-LacZ-Zellen
- Halten Sie alle 2 - 3 Tage eine regelmäßige Passage im Verhältnis 1:10,
aufrecht
Anmerkung: Lassen Sie die Zellen nicht in Konfluenz hineinwachsen, da dies zu ihrer Differenzierung führt.
- Teilen Sie die Kulturen bei einem Zusammenfluss von 80-90% auf. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 1 ml Trypsin hinzu, inkubieren Sie es 5 min. Geben Sie 9 ml Nährmedium hinzu, pipettieren Sie auf und ab und teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:10 für die Passage.
- Einfrieren von F9 RARE-LacZ-Zellen
- Trypsinisieren Sie eine 10 cm große Schale, die F9 RARE-LacZ-Zellen bei 80 - 90 % Konfluenz enthält, wie in Schritt 2.2.2 beschrieben. Die dissoziierten Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen geben und 5 min bei 200 x g schleudern.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml F9 RARE-LacZ Gefriermedium (siehe Tabelle 2). Aliquotieren Sie 1 ml in etikettierte Kryoröhrchen und füllen Sie die Fläschchen in Gefrierbehälter um. Stellen Sie den Gefrierbehälter in den -80 °C Gefrier-O/N und stellen Sie die Fläschchen am nächsten Tag in Flüssigstickstofftanks um.
>3. Laminektomie, Dissektion des lumbalen Rückenmarks bei Erwachsenen und Neurosphärenkultur
- Laminektomie
- Opfern Sie eine erwachsene Maus (P60) durch Gebärmutterhalsluxation.
- Besprühen Sie die Rückenseite mit 70% Ethanol und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Querschnitt. Ziehen Sie beide Lappen (anterior und posterior) auseinander, um den Rücken und die Wirbelsäule freizulegen.
- Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Muskeln ab, die die Wirbelsäule bedecken. Lokalisiere die Lendenwirbelsäule des Rückenmarks unterhalb der Rippen. Mache mit der Schere einen tiefen Schnitt, um die Wirbelsäule an dieser Stelle zu durchtrennen und das Rückenmark freizulegen.
- Ziehen Sie den Lendenwirbelsäulenbereich mit der Pinzette Nr. 5 nach oben, so dass der freiliegende Querschnitt des Rückenmarks dem Versuchsleiter zugewandt ist. Schneiden Sie mit den Spitzen einer feinen Schere den Wirbel und den Muskel in der 3-Uhr- und 9-Uhr-Position des freiliegenden Endes ab. Fassen Sie den Rückenlappen des durchtrennten Wirbels mit einer Pinzette. Setzen Sie diese Schnitte kaudal fort, bis die Länge des lumbalen Rückenmarks freiliegt.
- Lösen Sie das Rückenmark von den Wirbeln mit der Pinzette Nr. 5 sowie mit der stumpfen Pinzette. Übertragen Sie das Rückenmark in ein 15-ml-Röhrchen mit 3 ml DMEM/F12-Kulturmedium. Auf Eis halten, bis alle lumbalen Rückenmark isoliert sind.
- Dissektion des Rückenmarks
- Gießen Sie das Nährmedium mit dem Rückenmark in eine 6 cm große Schale (nicht mit Zellkultur behandelt).
- Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop die Spinalganglien und Blutgefäße um das Rückenmarksegment, indem Sie sie mit zwei Paaren Pinzetten Nr. 5 greifen und vorsichtig vom Rückenmark wegziehen. Übertragen Sie das Rückenmarkssegment in eine 6 cm lange Schale ohne Medium und hacken Sie das Gewebe mit einer Skalpellklinge fein auf.
- Übertragen Sie das gehackte Gewebe in ein 15-ml-Röhrchen mit 1 ml Neurosphären-Dissoziationsmedium (siehe Tabelle 2). Legen Sie den Schlauch auf Eis und wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 - 3.2.2, bis alle Rückenmark bearbeitet sind.
- Röhrchen mit gehacktem Gewebe in Dissoziationsmedium bei 37 °C für 10 min inkubieren, zum Mischen das Röhrchen an der Seite schnippen und dann weitere 10 min bei 37 °C inkubieren. Nach dem enzymatischen Aufschluss mit feuerpolierten Pipetten mit abnehmendem Durchmesser zur mechanischen Dissoziation zerreiben.
Anmerkung: Bereiten Sie feuerpolierte Pipetten mit abnehmendem Durchmesser vor, bevor Sie Experimente durchführen. Nehmen Sie eine Pasteur-Pipette aus Glas und verstopfen Sie das breite Ende mit sauberer Watte. Mit einer Alkohollampe die Spitzen der Pipetten in der Flamme feuerpolieren, um verschiedene Durchmesser zu erhalten: "normal", "fein" und "extra fein". Bei "normalen" polierten Pipetten drehen Sie das Ende der Pipette in der Flamme, um die Ränder abzurunden, ohne den Durchmesser zu verringern (~ 1 mm). Drehen Sie das Ende der Pipette etwas länger in der Flamme, um "feine" (~ >1 mm und > 5 mm Durchmesser) und "extra feine" (~ 0,5 mm) polierte Pipetten zu erzeugen. Verwenden Sie keine Pipetten mit einem Durchmesser von weniger als 0,5 mm.
- Kultur der Neurosphäre
- Schleudern Sie Röhrchen mit dissoziiertem Rückenmarksgewebe in einer Dosis von 200 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Neurosphären-Kulturmedium (siehe Tabelle 2). Zerreiben Sie mit einer P1.000-Pipette, gefolgt von einer P200-Pipette, um die Dissoziation zu erleichtern.
Anmerkung: Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen, die die Lebensfähigkeit der Zellen verringern würden.
- Übertragen Sie 10 μl dissoziierte Zellen in ein Hämozytometer und erhalten Sie eine Zellzählung. Plattenzellen mit einer Dichte von 1x105/10 ml in einem T25-Kolben mit 10 ml Neurosphären-Kulturmedien. Bei 37 °C und 5 % CO2 7 Tage inkubieren, bis Neurosphären erscheinen.
- Dissoziation der Neurosphäre
- Sammeln Sie die Neurosphärenkultur und übertragen Sie sie in 15-ml-Röhrchen. Bei 200 x g für 10 min schleudern. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands und lassen Sie 1 ml zurück. Triturieren Sie mit einer P1.000-Pipette, um das Zellpellet zu resuspendieren und Neurosphären in einzelne Zellen zu dissoziieren. Übertragen Sie 10 μl dissoziierte Zellen in ein Hämozytometer und erhalten Sie eine Zellzählung.
- Platte: 1 x 105 dissoziierte Neurosphärenzellen über einer Vertiefung F9 RARE-LacZ in einer 96-Well-Platte (siehe Abschnitt 5.1 zur Beschichtung von F9 RARE-LacZ in einer 96-Well-Platte). Tafel 3 Wells als Replikate. Kultur O/N bei 37 °C und 5 % CO2.
>4. Retinsäure (RA) Assay von Spinalmark-Neurosphären
- Beschichtung F9 RARE-LacZ in 96-Well-Platte
- Einen Tag vor der Dissoziation der Neurosphären wird eine 96-Well-Platte 30 Minuten lang bei RT mit 100 μl 0,2 % Gelatine pro Well bestrichen. Die Gelatine wird abgesaugt und zweimal mit 200 μl destilliertem Wasser gespült.
- Trypsinisieren Sie F9 RARE-LacZ-Zellen, die in 10-cm-Schalen aufbewahrt werden, wie in Schritt 2.2.2 beschrieben. Platte 1 x 105 Zellen/Well mit F9-RARE LacZ-Zellen, diesmal jedoch mit Kulturmedium ohne G418.
- Bereiten Sie genügend Wells für die Co-Kultur der Neurosphären (3 Wells/Genotyp) und für eine Standardkurve in dreifacher Ausführung (27 Wells) vor.
- Co-Kultur von F9 RARE-LacZ und Spinalmark-Neurosphären
- Dissoziieren Sie Neurosphären und Platte auf F9 RARE-LacZ in der 96-Well-Platte, wie in Schritt 3.4 beschrieben. Kultur O/N bei 37 °C und 5 % CO2.
- Generieren einer Standardkurve
- Um eine Standardkurve zu erstellen, bereiten Sie all-trans-RA (at-RA)-Lösungen mit den folgenden Konzentrationen her: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, durch serielle Verdünnung des at-RA-Stammes (siehe Tabelle 1) mit F9 RARE-LacZ-Kulturmedium.
- 100 μl dieser unterschiedlichen at-RA-Konzentrationen werden zu F9 RARE-LacZ-Zellen aus Abschnitt 4.1 gegeben. Weisen Sie Vertiefungen mit unbehandelten F9 RARE-LacZ-Zellen als Negativkontrolle zu. Bereiten Sie Triplikate jeder RA-Konzentration und Negativkontrollvertiefungen vor. Kultur O/N bei 37 °C und 5 % CO2,
Anmerkung: F9 RARE-LacZ-Zellen reagieren dosisabhängig linear auf unterschiedliche Konzentrationen von all-trans RA .
- RA-Assay
- Entfernen Sie nach der O/N-Kultur der 96-Well-Platte, die die Standardkurven und Co-Kulturen enthält, das Medium und fixieren Sie die Kulturen, indem Sie 100 μl 2,5 % Glutaraldehyd (siehe Tabelle 2) für 15 min, RT, hinzufügen. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie zweimal mit 200 μl 1x PBS, 10 min pro Waschgang.
- PBS entfernen und dreimal mit 200 μl der LacZ-Waschlösung waschen (siehe Tabelle 2), 10 min pro Waschgang. Bereiten Sie bei der dritten Wäsche die X-Gal-Färbelösung in einer in Folie eingewickelten 15-ml-Tube vor (siehe Tabelle 2). Berechnen Sie, wie viel Färbelösung benötigt wird und bereiten Sie die entsprechende Menge (200 μl/Well) vor.
Anmerkung: X-gal Färbelösung ist lichtempfindlich. Verwenden Sie die Färbelösung innerhalb von 15 Minuten nach der Zubereitung.
- Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer vor, indem Sie ein mit destilliertem Wasser angefeuchtetes Papiertuch in einen Plastikbehälter legen, der groß genug ist, um eine 96-Well-Platte aufzunehmen. Geben Sie 200 μl der X-Gal-Färbelösung pro Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu und stellen Sie die Platte in eine befeuchtete Kammer.
- Die befeuchtete Kammer mit der 96-Well-Platte wird 4 bis 8 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, um die Entwicklung von blauem Niederschlag zu ermöglichen.
- Leseabsorption an OD610 und Bildgebung
- Entfernen Sie nach der Farbreaktion die LacZ-Färbelösung und ersetzen Sie sie durch 200 μl 1x PBS. Messen Sie die Absorption bei 610 nm mit einem Standard-ELISA-Platten-Reader, um die Reporterreaktion auf RA zu quantifizieren. Bilden Sie einzelne Wells mit einem Standard-Stereomikroskop ab, das mit einer Kamera ausgestattet ist.
Tabelle 1. Puffer und Lösungszusammensetzungen.
| Lagerpuffer/Lösungen | Komponenten | Lagerbedingungen |
| 10% Natriumdesoxycholat-Monohydrat (C24H39NaO4 · H2O) | 10 ml in 100 ml dH2O | 4 ºC |
| 1 M Magnesiumchlorid (MgCl2) | | Rt |
| 100x Kaliumferrocyanid (K4[Fe(CN)6]·3H6O) | 2,12 g in 10 ml dH2O | RT im Dunkeln |
| 100x Kaliumferricyanid (K3[Fe(CN)6]) | 1,64 g in 10 ml dH2O | RT im Dunkeln |
| 20 mg/ml X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-d-galactopyranosid) | Fügen Sie 5 ml Dimethylformamid hinzu, um 20 mg/ml Stammlösung herzustellen | -20 ºC |
| 10 mM (3 mg/ml) all-trans-Retinsäure | 50 mg in 16,67 ml absolutem Ethanol auflösen. Bereiten Sie 1 ml Aliquots vor. | -80 ºC im Dunkeln, in 1,5 ml bernsteinfarbenen Mikrozentrifugenröhrchen |
| Papain | Eine Durchstechflasche in 7 ml HBSS auflösen | 4 ºC |
Tabelle 2. Arbeitspuffer und Lösungszusammensetzungen.
| Arbeitspuffer/Lösungen | Komponenten | Lagerbedingungen |
| F9 RARE-LacZ Zellkulturmedium | 50 ml fötales Rinderserum (FBS) (Endkonzentration 10%) | Filter-sterilisieren. |
| 5 ml 100x Penicillin Streptomycin (final conc 1X) | Bei 4 ºC lagern. |
| 4 ml 50 mg/ml G418 (Endkonzentration 0,4 mg/ml) | |
| bis 500 ml DMEM/F-12 (mit L-Glutamin und HEPES) | |
| 0,2% Gelatine | 25 ml 2,0% Gelatine | Bei 4 ºC lagern. |
| 80 ml destilliertes Wasser | |
| Gut mischen | |
| 70% Ethanol | 30 ml 95% Ethanol | In eine Sprühflasche geben. |
| 70 ml destilliertes Wasser | Bei RT shoppen |
| Dissoziationsmedium der Neurosphäre | 1 ml 20U Papain | Jedes Mal frisch zubereiten |
| 100 μl 13 mg/ml Trypsin | |
| 100 μl 7 mg/ml Hyaluronsäure | |
| 28 μl 10 mg/ml DNaseI | |
| 50 μl 4mg/ml Kynurensäure | |
| Kulturmedium für Neurosphären | DMEM/F-12 (mit L-Glutamin und HEPES) | Jedes Mal frisch zubereiten |
| 2% B-27 Zuschlag | |
| 20 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) | |
| 20 ng epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) | |
| 2,5 % Glutaraldehyd | 250 μl 50% Glutaraldehyd | Jedes Mal frisch zubereiten |
| 4750 μl 1x PBS | |
| LacZ Waschlösung | 0,5 ml 10 % Desoxycholat (Endkonzentration 0,1 %) | Bei 4 ºC lagern. |
| 1,0 ml 100% NP-40 (Endgehalt 0,2%) | |
| 50 ml 10X PBS | |
| destilliertes Wasser bis 500 ml | |
| X-Gal Färbelösung | 1x Kaliumferrocyanid | Jedes Mal frisch zubereiten |
| 1x Kaliumferricyanid | |
| 1 mg/ml X-gal | |
| auf das passende Volumen mit LacZ Waschlösung | |
| F9 RARE-LacZ Gefriermedium | F9 RARE-LacZ Nährmedium + 5 % DMSO | Jedes Mal frisch zubereiten |
