Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Chirurgischer Eingriff
Hinweis: 20 männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden mit zusammengesetztem Amyloid-Beta-Protein (Aβ) in den lateralen Ventrikel und den anterodorsalen Thalamuskern mikroinjiziert und als zusammengesetzte Aβ-behandelte Gruppe bezeichnet. Weitere 20 Ratten wurden der gleichen Operation unterzogen, erhielten jedoch eine Mikroinjektion von 0,1 % Dimethylsulfoxid (DMSO) Kochsalzlösung und wurden als scheinoperierte Gruppe bezeichnet.
- Betäuben Sie die Ratten mit 100% Isofluran durch Inhalation und fesseln Sie sie dann an einem stereotaktischen Gerät des Gehirns.
- Rasieren Sie das Fell am Scheitel des Kopfes mit einer chirurgischen Schere und desinfizieren Sie es mit Jodophor. Decken Sie dann ein Einweg-OP-Handtuch auf den Kopf ab.
- Machen Sie einen Schnitt an der Kopfhaut entlang der medianen longitudinalen Schädeldecke mit chirurgischen Bistouries und Scheren.
- Trennen Sie das Unterhautgewebe und die Faszie, wischen Sie das Schädelschädelschädel mit steriler, trockener Watte ab, um die Blutung zu stoppen, und markieren Sie das Bregma mit einem Markierungsstift.
- Beziehen Sie sich auf die Stereotaxische Karte des Rattengehirns, indem Sie das Bregma als Ausgangspunkt berücksichtigen, markieren Sie die drei Punkte, den anterodorsalen Thalamuskern (ad) (posterior (P): 2,0 mm zum Bregma; lateral (L): 1,4 mm bis zur Mittellinie) für die Injektion des rekombinanten humanen transformierenden Wachstumsfaktors-β1 (RHTGF-β1) und die Fixierung einer Schraube, des Bereichs des lateralen Ventrikels (LV) (posterior (P): 0,8 mm zum Bregma; lateral (L): 2,0 mm zur Mittellinie) zur Injektion des Amyloid-Beta-Proteins 25-35 (Aβ25-35) und Aluminiumtrichlorid (AlCl3) und der zweiten Befestigungsstelle der Schraube (Front (F): 2,0 mm zum Bregma; lateral (L): 1,5 mm zur Mittellinie).
- Bohren Sie vorsichtig drei Löcher mit einem Durchmesser von 1 mm mit einem flexiblen Knochenbohrer, der an den oberen drei Punkten des Schädels (1,5. Schritt) gekennzeichnet ist. Schrauben Sie nicht tiefer als nötig, um ein Stechen in das Hirngewebe zu vermeiden.
- Stoppen Sie die Blutung und reinigen Sie die Schädeloberfläche wiederholt mit steriler, trockener Baumwolle.
- Führen Sie eine Nadel, die mit der Mikroinjektionspumpe verbunden ist, in 4,6 mm Tiefe in das Gehirn ein und injizieren Sie vorsichtig 1 μl RHTGF-β1 (10 ng) in den Ad-Bereich. Lassen Sie die Nadel nach der Injektion 2 Minuten lang und ziehen Sie die Nadel langsam heraus.
- Befestigen Sie die beiden Schrauben in den Schädel, die in den Punkten der Anzeige gekennzeichnet sind, und die zweite Befestigungsstelle der Schraube des Schädels (die in Stufe 1,5 bezeichnet wurde) mit einem kleinen Schraubendreher. Schrauben Sie nicht tiefer als nötig, um ein Stechen in das Hirngewebe zu vermeiden.
- Montieren Sie das Kanülenimplantationssystem und führen Sie die Dummy-Kanüle nach der Desinfektion durch hohen Druck in die Führungskanüle ein.
- Führen Sie die Führungskanüle aus Edelstahlrohr zum Gehirn in einem Abstand von 4,6 mm in den LV-Bereich durch das Schädelloch mit Hilfe des Kanülenhalters des stereotaktischen Apparates der Ratte ein.
- Mischen Sie das Prothesenbasismaterial mit Prothesenbasiswasser in einem Verhältnis von 1,5 g pro 1 ml, geben Sie die Paste auf den Kunststoffsockel der Führungskanüle und zwei Schrauben, um die Führungskanüle zu immobilisieren und den gesamten Hautschnitt abzudecken, um Hautinfektionen zu vermeiden.
- Am Tag 2 der Operation wurden die Ratten mit Isofluran-Inhalation mit dem Kleintieranästhesiegerät betäubt. Ziehen Sie die Dummy-Kanüle heraus, führen Sie die Innenkanüle in die Führungskanüle ein und schrauben Sie die Fixierschraube fest, um die Innenkanüle ruhigzustellen.
- Stellen Sie das Polyethylenrohr, das die Mikroinjektionspumpe mit der internen Kanüle verbindet, ein und regulieren Sie die Injektionsgeschwindigkeit auf 1 μl/min. Mikroinjektion des Aβ25-35 oder AlCl3 in das LV.
- Mikroinjektion von 4 μg (1 μL) Aβ25-35 täglich für 14 Tage morgens und 3 μl AlCl3 (1%) täglich für 5 Tage nachmittags unter Isofluran-Anästhesie.
- Warten Sie 5 Minuten nach Beendigung der Injektion, ziehen Sie die innere Kanüle vorsichtig heraus und führen Sie die Dummy-Kanüle wieder in die Führungskanüle ein.
- Am 15. Tag, nach der Operation (was dem letzten Injektionstag von Aβ25-35 entspricht), wird das Kanülenimplantationssystem demontiert. Entfernen Sie vorsichtig mit einer chirurgischen Schere und Pinzette das Prothesengrundmaterial, lösen Sie die beiden Schrauben, ziehen Sie die Führungskanüle heraus und desinfizieren Sie die Wunde mit Betadin. Füllen Sie das Loch des Schädels mit Knochenzement und nähen Sie die Haut mit einer einfachen Methode der unterbrochenen Naht.
- Führen Sie den gleichen Vorgang mit der scheinoperierten Gruppe durch und mikroinjizieren Sie 0,1 % DMSO-Kochsalzlösung.
