Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
C57BL/6 (H-2b) weibliche Mäuse, 8 Wochen alt, wurden gekauft und C57BL/6 AQP4-/- Mäuse wurden von A. Verkman zur Verfügung gestellt.
1. Immunisierung von Mäusen mit AQP4-Peptiden
- Bereiten Sie das vollständige Freund's Adjuvans (CFA) Working Stock vor.
- Ein getrocknetes Präparat aus Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) mit einem Mörser und Stößel fein zerkleinern.
- Geben Sie gemahlenes H37Ra zu unvollständigem Freund-Adjuvans bis zu einer Endkonzentration von 4 mg/ml. CFA kann bis zu 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
Löse das - lyophilisierte Antigen (Ag) AQP4-Peptid in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml. Bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren.
- Bereiten Sie die Montage von 2 Luer-Lock-Spritzen vor, die mit einem Absperrhahn verbunden sind und die CFA/Peptid-Emulsion enthalten.
- Befestigen Sie eine Luer-Lock-Spritze aus Glas ohne Kolben an einem 3-Wege-Nylonhahn mit 2 Luer-Lock-Anschlüssen für Männer. Schließen Sie den Absperrhahn, indem Sie den Hebel in Richtung Spritze bewegen. Positionieren Sie das offene Ende der Spritze nach oben, so dass die Spritze als Reagenzglas fungieren kann. Legen Sie es für zusätzliche Stabilität in ein Röhrchengestell.
- Vortexen Sie den CFA-Arbeitsstock und die Ag-Lösung. Geben Sie ein 1:1-Volumen Peptid / CFA in die offene Spritze. Pro Maus werden 200 μl CFA/Ag (4 x 50 μl) benötigt.
Anmerkung: In der Regel geht etwa 1 ml des Präparats im Absperrhahn verloren, wodurch die für die Immunisierung verfügbare Menge verringert wird. Daher ist es wichtig, dies in die Berechnung des benötigten Gesamtvolumens einzubeziehen.
Beispiel: Für die Immunisierung von 5 Mäusen: (200 μl/Tier x 5 Tiere) + 1 mL zusätzliches Volumen = 2 mL Gesamt-CFA/Ag erforderlich.
- Führen Sie den Glaskolben in die Spritze ein und drehen Sie die Spritze um, während Sie ihn festhalten, so dass der Absperrhahn nach oben ausgerichtet ist. Schalten Sie den Absperrhahnhebel auf den unbenutzten weiblichen Anschluss. Üben Sie vorsichtig Druck auf den Glaskolben aus, um überschüssige Luft aus der Spritze zu entfernen. Die Flüssigkeit füllt den zweiten männlichen Luer-Lock-Anschluss des Absperrhahns.
- Befestigen Sie eine zweite Glasspritze (Kolben vollständig eingesetzt) an den zweiten Luer-Lock-Anschluss des Absperrhahns. Dabei sollte es sich um ein geschlossenes System aus 2 Glasspritzen handeln, die mit einem Absperrhahn verbunden sind, der so wenig überschüssige Luft wie möglich enthält.
- Um eine Emulsion zu erzeugen, mischen Sie, indem Sie die Kolben drücken, um die Flüssigkeit abwechselnd zwischen den 2 Spritzen für etwa 2 Minuten zu leiten. Kühlen Sie die Spritzen etwa 10 Minuten lang auf Eis. Wiederholen Sie das Kühlen und Mischen, bis sich die Viskosität der Zubereitung deutlich ändert, was zu einer sehr steifen, weißen Emulsion führt. Die Spritzen mit der Emulsion bei 4 °C kühlen oder auf Eis halten.
- Übertragen Sie die gesamte Emulsion auf eine Luer-Lock-Glasspritze, entfernen Sie die leere Glasspritze und ersetzen Sie sie durch eine 1-ml-Luer-Lock-Spritze zur Injektion. Füllen Sie die neue Spritze mit Emulsion, nehmen Sie sie aus dem Absperrhahn und befestigen Sie eine Nadel (25G x 5/8).
- "Wassertest" die Emulsion auf Konsistenz. Einen Tropfen der Emulsion in eine kleine Schüssel mit Wasser geben. Die Emulsion sollte sich nicht dispergieren, was darauf hinweist, dass sie für die Injektion geeignet ist.
- Wenn sich die Emulsion auflöst, ist sie nicht bereit für die Injektion; die Flüssigkeit zurück in die Glasspritzen geben und weiter mischen und dann erneut kalt stellen, bis die Emulsion steif ist.
- Testen Sie die Emulsion erneut, bis die richtige Konsistenz erreicht ist.
- Spender-AQP4-/- Mäuse subkutan (s.c.) mit einer Emulsion injizieren, die das AQP4-Peptid enthält. Jede Maus erhält 4 x 50 μl s.c. Injektionen (200 μl insgesamt (100 μg Peptid)). Die 4 Stellen umfassen beide Seiten des Unterbauchs, die in die leistenförmigen Lymphknoten (LN) abfließen, und beide Seiten der Brustwand medial zu jeder Achselhöhle, die in den axillären LN abfließen. Für den adoptiven Transfer werden 1-2 immunisierte Spendermäuse pro Empfängermaus benötigt.
>2. T-Zellkultur und proinflammatorische T-Zell-Polarisation
- Sammeln Sie 10-12 Tage nach der Immunisierung LN von den Mäusen.
- Bereiten Sie in einer Eisschale 60-mm-Petrischalen vor, die mit einem Zellsieb (Maschenweite 70 μm) ausgestattet sind und gekühlte Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und 100 μm Penicillin-100 μg/ml Streptomycin (Pen-Streptokokken) (RFPS) enthalten.
- Euthanasieren Sie Mäuse durch Exposition gegenüber CO2, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Tauchen Sie die Mäuse in 70%iges Ethanol und stecken Sie dann jedes Fußpolster an ein Sezierbrett.
- Schneide einen Hautschnitt in der Mittellinie von der Leiste bis zum Hals und an jedem Bein hinunter. Ziehe die Haut vom Bauchfell weg und stecke sie straff an das Brett. Leisten- und Achsel-LN präparieren und in die Petrischale mit RFPS auf Eis legen.
- Kombinieren Sie für Adoptivtransferversuche LN von allen Tieren innerhalb derselben Immunisierungsgruppe. Für durchflusszytometrische Analysen des Vβ-Verbrauchs ist LN von einzelnen Tieren zu trennen.
- Legen Sie das Zellsieb mit dem LN auf ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit RFPS. Verwenden Sie das flache Ende eines sterilen 5-ml-Spritzenkolbens, um die LN-Zellen durch das Sieb zu drücken, und waschen Sie sie mit 20-30 mL RFPS, um die Wiederherstellung der Zellen zu erleichtern. Bewahren Sie LN-Zellen während der gesamten Verarbeitung bis zur Kulturphase auf Eis auf.
- Zweimal waschen und 5 Min. bei 393 x g zentrifugieren. Nach der zweiten Wäsche resuspendieren Sie die LN-Zellen in T-Zell-Medien (TCM). TCM enthält RPMI mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 292 μg/ml L-Glutamin, 110 μg/ml Natriumpyruvat und 55 μM 2-Mercaptoethanol und Pen-Streptokokken. In der Regel wird ein Volumen von 5 mL TCM pro Spendermaus verwendet.
- Zählen Sie die LN-Zellen. Die erwartete Ausbeute beträgt ca. 3-6 x 107 LN-Zellen pro immunisiertem Mausspender.
- Richten Sie polarisierende Kulturen für den adoptiven Transfer ein.
- Bereiten Sie eine Th17-Polarisationskultur von 5 x 106 LN-Zellen pro ml mit 10 μg/ml Ag, 20 ng/ml rekombinantem Maus-Interleukin (IL)-23 und 10 ng/ml rekombinantem Maus-IL-6 in der TCM vor.
- Alternativ kann für die Th1-Polarisation eine Kultur von 5 x 106 LN-Zellen pro ml mit 10 μg/mL Ag und 10 ng/ml rekombinantem Maus-IL-12 in der TCM vorbereitet werden.
- Geben Sie 2 ml (1 x 107 Zellen) der polarisierenden Kulturmischung pro Vertiefung in eine 12-Well-Platte. Die LN-Zellen von 2-4 Spendermäusen füllen eine 12-Well-Platte. Halten Sie die Kulturen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 für 72 h.
- Überprüfen Sie die LN-Zellen in Kultur visuell auf Aktivierung nach 48 h und 72 h. Aktivierte Zellen bilden ausgedehnte Cluster und die T-Zellen nehmen an Größe zu und werden pleomorpher. Die Erhöhung des Stoffwechsels führt zu einer Absenkung des pH-Werts im Medium, der von Pfirsich zu Orange wechselt. Wenn der pH-Wert niedrig genug ist, um das Medium gelb zu färben, fügen Sie in den verbleibenden 24 Stunden 1 ml frisches TCM hinzu, um eine Toxizität für die Zellen zu vermeiden.
- Fahren Sie mit der Adoptionsübertragung fort.
>3. Adoptiver Transfer von pathogenen AQP4-spezifischen T-Zellen
HINWEIS: Dieser Schritt folgt aus Abschnitt 2.5: T-Zellkultur und proinflammatorische T-Zell-Polarisation.
- Erholen Sie polarisierte Zellen von 12-Well-Platten, indem Sie sie zum Entfernen auf und ab pipettieren und in ein 50-ml-Röhrchen übertragen. Bis zu den Injektionen auf Eis halten.
- Zählen Sie die Zellen, waschen Sie sie zweimal in kaltem PBS und bereiten Sie eine Suspension von 1 x 108 Zellen/ml in PBS vor. Injizieren Sie die Zellen im Allgemeinen innerhalb einer Stunde.
- Mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie schwenken, und geben Sie sie zum Zeitpunkt der Injektion in eine 1-ml-Spritze. Verabreichen Sie jeder Maus 200 μl der Zellen (2 x 107) intravenös (i.v.) durch die Schwanzvene.
- Injizieren Sie jeder Empfängermaus i.p. 200 ng B. pertussis-Toxin, verdünnt in 200 μl PBS, an diesem Tag und 2 Tage später. Überwachen Sie Mäuse täglich auf Anzeichen einer klinischen Erkrankung.
