Immunfluoreszenzfärbung neuronaler Populationen im embryonalen gastrointestinalen Trakt der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Barlow-Anacker, A. J., et al., Immunfärbung zur Visualisierung der Entwicklung des enterischen Nervensystems der Maus. J. Vis. exp. (2015)

Dieses Video zeigt die Immunfärbung des embryonalen murinen Magen-Darm-Trakts, um die Verteilung der neuronalen Population mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Mikroskopie zu visualisieren und zu analysieren.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Immunfärbeprotokoll

1. Wenn Proben in 30%iger Saccharose gelagert wurden, spülen Sie diese 3 Mal für 20 min in 1x PBS auf einer Wippplattform
aus.
2. Legen Sie die Magen-Darm-Trakte für 1 Stunde bei RT in die Blockierungslösung auf einer Schaukelplattform.
3. Entfernen Sie die Blockierungslösung und inkubieren Sie den Magen-Darm-Trakt mit der entsprechenden Menge an Primärantikörpern, verdünnt in der Blockierungslösung für entweder 4 Stunden bei RT oder O/N bei 4 °C auf einer Wippplattform. Verwenden Sie eine 1:1.000-Verdünnung des humanen Anti-Hu-Antikörpers (vom Patienten erhaltenes Serum), eine 1:1.000-Verdünnung des Hühner-Anti-Grünfluoreszenz-Protein-Antikörpers (GFP) und eine 1:100-Verdünnung des Ziegen-Anti-ChAT-Antikörpers.
   Anmerkung: Wir verwenden einen humanen Anti-Hu-Antikörper, der vor Ort von einem Patienten gewonnen wurde; Anti-Hu-Antikörper sind jedoch im Handel erhältlich, z. B. Maus-Anti-Hu (Verwendung in einer Verdünnung von 1:500).
4. Spülen Sie den Magen-Darm-Trakt in 1x PBS 3 Mal für 5 min und dann für 1 Stunde bei RT auf einer Schaukelplattform.
5. Ersetzen Sie das 1x PBS durch Sekundärantikörper, die 1:500 in Blockierungslösung auf einer Schaukelplattform verdünnt sind, entweder 4 Stunden bei RT oder O/N bei 4 °C. Verwenden Sie einen Esel-Anti-Human-Amin-Reaktivfarbstoff wie Dylight, ein Esel-Anti-Hühner-Cy2 und ein Esel-Anti-Ziegen-Cy5. Wenn Sie den Maus-Anti-Hu-Antikörper verwenden, verwenden Sie eine Verdünnung von 1:500 des Esel-Anti-Maus-Amin-Reaktivfarbstoffs 405.
   Anmerkung: Die Intensität der endogenen GFP- und tdTomato-Expression und die Klarheit der Immunfärbung nehmen mit zunehmendem Alter zu. In der Regel immunfärben wir embryonale Därme einzeln in 0,2-ml-Röhrchen mit 150 μl Färbelösung, um das Volumen des verwendeten Antikörpers zu reduzieren und eine effiziente Färbung des Gewebes zu gewährleisten.
6. Spülen Sie den Magen-Darm-Trakt in 1x PBS 3 Mal für 5 min und dann für 1 Stunde bei RT auf einer Schaukelplattform.
7. Geben Sie einige Tropfen Fluoreszenz-Eindeckmedium mit DAPI auf einen Objektträger. Tauchen Sie den Magen-Darm-Trakt in das Fluoreszenz-Eindeckmedium und fügen Sie ein Deckglas direkt auf das Gewebe hinzu. Das Fluoreszenz-Eindeckmedium -G ist eine wasserlösliche Verbindung, die eine semi-permanente Abdichtung bietet.
   Anmerkung: Verwenden Sie Fluoreszenz-Eindeckmedium wie Vectashield, ein Eindeckmedium auf Glycerinbasis, das das Verblassen von Antikörpern und Photobleichen verhindert. Beide Produkte ermöglichen die Lagerung von Geweben über lange Zeiträume bei 4 °C.
8. Nehmen Sie Bilder von jedem Fluorophor mit einem konfokalen Mikroskop auf. Verwenden Sie die Anregungswellenlängen für Fluorophore und Filter, die in Tabelle 1 verwendet werden.
9. Führen Sie eine computergestützte Bildanalyse mit geeigneter Software durch, je nachdem, welche Art von Konfokal für die Bildaufnahme verwendet wird.

Tabelle 1: Konfokale Anregungswellenlängen, Fluorophore und Filter. Die verwendeten Anregungswellenlängen, detektierbaren Fluorophore und Filter werden vorgestellt. Diese Informationen können bei der Auswahl von Kombinationen von Sekundärantikörpern für die mehrfarbige Immunfluoreszenz verwendet werden.

Anregung			Emission
Laserlinie	Fluorophor-Typ	Beispiele	Photomultiplier-Röhre	Filter-Optionen
408 nm	blau	Alexa Fluor 405, Cascade Blue, Cumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, die meisten Quantenpunkte	1	BP 425-475 nm
488 nm	grün	Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1	arabische Ziffer	BP 500-550 nm
561 nm	rot	Alexa Fluor 546, 555, 568 und 594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, Phycoerythrin (PE), Propidium Iod (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC	3	BP 570-620 nm
638 nm	Fernes Rot	Alexa Fluor 633 und 647, Allophycocyanin (APC), Cy5, TO-PRO-3	4	BP 663-738 nm

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Oxoid	BR0014G
Rinderserumalbumin	Fischer	Nr. BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
Fluoreszenz-Oszilloskop	Nikon	Stereoskop SMZ-18
1,5 mL Eppendorf Röhrchen	VWR	Artikel-Nr.: 20170-038
Fluormount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	Tel.: 0100-01
Objektträger aus Glas	Fischer	Artikel-Nr.: 12-550-15
Deckglas	VWR	Nr. 16004-330
Konfokales Mikroskop	Nikon	Nikon A1
Nikon-Elemente	Nikon