$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Tiermodell
- Kreuzung von hemizygoten Tg(Gfap-luc+/-)-Mäusen (transgene Mäuse, die Glühwürmchen-Luciferase exprimieren) mit hemizygoten Tg(M83+/-)-Mäusen (transgene Mäuse, die humanes Alpha-Synuclein mit der familiären A53T-Mutation exprimieren), um hemizygote bigene Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)-Mäuse zu erzeugen.
- Genotypisierung der Nachkommen mittels real-time Polyemerase-Kettenreaktion (PCR) auf das Vorhandensein des Transgens, das für humanes Alpha-Synuclein kodiert, und mit Standard-PCR auf Glühwürmchen-Luciferase.
- Impfen Sie die Tiere im Alter von sechs bis acht Wochen.
>2. Vorbereitung des Inokulums
- Bereiten Sie monomeres rekombinantes humanes Alpha-Synuclein mit der A53T-Mutation in Tris-gepuffertem Kochsalzpuffer (TBS) vor, der 150 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) enthält.
- Bereiten Sie fibrilläres Alpha-Synuclein für die Inokulation vor, indem Sie 3 μg/μl monomeres rekombinantes humanes Alpha-Synuclein in einem Orbitalschüttler bei 800 U/min und 37 °C für 5 Tage rühren.
- Fibrillenanordnungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen, um eine Endkonzentration von 1 μg/μl für intraperitoneale Inokulationen zu erreichen.
- Fragmentieren Sie die Alpha-Synuclein-Fibrillen mit einem Stäbchen-Ultraschallgerät für 1 Minute (40 Pulse mit einer Dauer von 0,5 s mit einer Pause von einer Sekunde zwischen jedem Puls und einer auf 50 % eingestellten Amplitude) auf Eis. Um eine Kontamination durch Kreuzsaat zu vermeiden, verwenden Sie saubere Ultraschallsonden, um verschiedene Inokulum vorzubereiten.
>3. Intraperitoneale Injektionen
- Bei intraperitonealen Injektionen werden die Tiere kurz in einer Anästhesiekammer durch Inhalation mit Isofluran/Sauerstoff bei einer Flussrate von 2 l/min narkotisiert und der Verdampfer auf 2% eingestellt. Kneifen Sie den Zeh des Tieres ein und vergewissern Sie sich, dass es seine Hintergliedmaßen nicht zurückzieht, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.
- Füllen Sie eine 27 G Einweg-Injektionsspritze mit 50 μl beschallten Alpha-Synuclein-Fibrillen oder PBS.
- Injizieren Sie direkt in das Bauchfell der Maus und vermeiden Sie das Eindringen in den Dünndarm oder Blinddarm hinter der Bauchdecke, indem Sie das Tier in einer dorsalen Position halten, wobei der Kopf vom Untersucher weg und in einem Winkel von etwa 45° nach unten zeigt. Überwachen Sie die Tiere, bis sie sich von der Narkose erholt haben.