Zeitraffer-Bildgebung zur Überwachung der transzellulären Ausbreitung prionenähnlicher Proteine in transgenen Nematoden

Zusammenfassung

Quelle: Nussbaum-Krammer, C. I., et al. Untersuchung der Ausbreitung und Toxizität von Prionen-ähnlichen Proteinen mit dem Metazoen-Modellorganismus C. elegans. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur in vivo-Bildgebung von C. elegans, die prionenähnliche Proteine exprimieren, die mit rot fluoreszierendem Protein markiert sind. Das Protokoll beinhaltet die Immobilisierung von Nematoden auf einem Agarose-Pad für die konfokale Zeitraffermikroskopie, um die Proteinaggregation und den Transport innerhalb und zwischen den Zellen aufzudecken. Diese Technik ist entscheidend für die Untersuchung der Proteinaggregation im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen.

Protokoll

>1. Überwachung der transzellulären Ausbreitung von Prionen-ähnlichen Proteinen durch in vivo Zeitraffer-Bildgebung

HINWEIS: Züchten Sie C. elegans-Wildtyp- (WT) (N2) und transgene Linien nach Standardmethoden und kontrollieren Sie die Kultivierungstemperatur sorgfältig.

1. Erzeugung transgener Linien von C. elegans, die das prionenähnliche Protein exprimieren, das mit einem monomeren rot fluoreszierenden Protein (mRFP) markiert ist.
2. Bereiten Sie synchronisierte Populationen vor, indem Sie Eizellen legen oder nach Standardmethoden bleichen.
   1. Synchronisation durch Eiablage
      1. 10 - 20 trächtige adulte Tiere auf einen Teller geben und 1 - 2 Std. Eier legen lassen. Adulte Tiere vom Teller nehmen und die Nachkommen bis zum gewünschten Alter heranwachsen lassen.
   2. Synchronisation durch Bleaching
      1. Sammeln Sie eine unsynchronisierte Population trächtiger adulter Tiere und bleichen Sie sie mit einer alkalischen Hypochloritlösung (250 mM Natriumhydroxid (NaOH) und 1:4 (v/v) Verdünnung von handelsüblichem Bleichmittel in Wasser (H₂O)). Die Eier zweimal waschen (218 x g für 1 min) mit M9-Puffer (21 mM Na₂HPO 4,7H₂O (Dinatriumhydrogenphosphat-Heptahydrat), 22 mM (Kaliumdihydrogenphosphat), KH₂PO₄, 86 mM Natriumchlorid (NaCl), 1 mM MgSO_{4,7H 2}O (Magnesiumsulfat-Heptahydrat), dH₂O bis zu 1 L zugeben).
      2. Lassen Sie sie in M9-Puffer unter leichtem Rühren über Nacht bei 20 °C (O/N) schlüpfen. Die Wurmentwicklung wird im L1-Stadium gestoppt, wenn keine Nahrungsquelle vorhanden ist, so dass eine synchronisierte Population zurückbleibt. Übertragen Sie L1s auf frische Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)-Platten, die mit OP50 E. coli-Bakterien besiedelt sind, und lassen Sie die Nachkommen bis zum gewünschten Alter entwickeln.
3. 2% Agarose-Pads (in H₂O) wie beschrieben auf einem Objektträger vorbereiten.
   1. Bereiten Sie zwei Objektträger mit einem Beschriftungsband vor, das über die gesamte Länge als Abstandshalter verwendet werden kann. Legen Sie einen dritten Objektträger dazwischen.
   2. 2 % Agarose werden in H₂O aufgelöst und ein Tropfen auf den sauberen Objektträger pipettiert.
   3. Lege einen vierten Objektträger senkrecht zu den drei anderen Objektträgern auf den Agar-Tropfen. Drücken Sie es vorsichtig nach unten, um das Pad auf die gleiche Dicke wie das Beschriftungsband abzuflachen.
   4. Lassen Sie es 1 Minute trocknen, bevor Sie die Abstandshalter entfernen und die Folien vorsichtig auseinanderziehen. Das Agar-Pad bleibt an einem von ihnen haften.
4. Pipettieren Sie ~10 μl Anästhetikum (2 mM Levamisol in M9-Puffer) auf das Pad und übertragen Sie ~10 Tiere mit einem Platindrahtpickel. Decken Sie sie mit einem Deckglas (~22 x 22 mm) ab und nehmen Sie Bilder innerhalb von 1 Std. auf.
5. Um Filme über einen längeren Zeitraum aufzunehmen oder die Möglichkeit einer Bewegung der Tiere weiter zu reduzieren, verwenden Sie alternativ eine Kombination aus Anästhetikum und Bead-Immobilisierung.
   1. Bereiten Sie 10 % Agarose-Pads (in M9-Puffer) wie beschrieben vor und fügen Sie Würmer zu 3 μl Nanokugel-Standardlösung (Polystyrolkügelchen, 100 nm) plus 3 μl Anästhetikum (4 mM Levamisol in M9-Puffer) hinzu. Decken Sie es vorsichtig mit einem Deckglas ab. Um Austrocknung zu vermeiden, versiegeln Sie das Deckglas mit VALAP (einer Mischung aus gleichen Mengen Vaseline, Lanolin und Paraffinwachs).
6. Bilde immobilisierte Würmer mit einem konfokalen Mikroskop.
   HINWEIS: Die Ergebnisse werden mit einem konfokalen Spinning-Disc-AF-Mikroskop erzielt, das mit einer EM-CCD-Kamera und einer Mikroskopie-Automatisierungs- und Bildanalysesoftware wie MetaMorph ausgestattet ist, aber es können auch andere vergleichbare konfokale Bildgebungssysteme verwendet werden.
   1. Verwenden Sie das Ölobjektiv 63X oder 100X/1,4NA und legen Sie den Objektträger mit den Würmern in den Objektträgerhalter.
   2. Öffnen Sie die Software. Passen Sie die Laserleistung und die Filter für die mRFP-Bildgebung an. Verwenden Sie den 561-nm-Laser bei 10 % Leistung und Emissionsfilter >600 nm.
   3. Öffnen Sie "Mehrdimensionale Erfassung". Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Haupt" die Kontrollkästchen für "Zeitraffer" und "Journale ausführen" (Hardware-Autofokus: aus).
   4. Wählen Sie unter dem Reiter "Speichern" den Verzeichnisordner aus oder erstellen Sie ihn, in dem die Dateien gespeichert werden sollen. Weisen Sie der Datei einen Namen zu.
   5. Wählen Sie auf der Registerkarte "Wellenlänge" die passende Beleuchtung aus und passen Sie Belichtung und Verstärkung an. Verwenden Sie "YokoQuad Red" (oder eine gleichwertige Beleuchtungseinstellung für mRFP-Bildgebung) mit einer Belichtung zwischen 100 und 300 ms und einem Kameragewinn zwischen 100 und 300, abhängig von der einzelnen Probe (bewertet anhand des Live-Bildes).
   6. Wählen Sie auf der Registerkarte "Zeitraffer" die Option "Anzahl der Zeitpunkte" = 301, "Dauer" = 5 Minuten und "Zeit/Intervall" = 1 Sek.
   7. Wählen Sie auf der Registerkarte "Journale" die Option "Journal: "AFC SET Z HOLD" und "AFC Return to Z HOLD", geben Sie ein: "Spezial" (zweimal), Anfangspunkt: "Beginn des Zeitpunkts" und "Ende des Zeitpunkts". Diese Autofokus-Option ist wichtig, um denselben Ausschnitt über einen längeren Zeitraum abzubilden.
   8. Wenn die Einrichtung abgeschlossen ist, drücken Sie auf "Erwerben". Das Zeitraffervideo wird als separate TIFF-Dateien gespeichert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz
Größenstandards für Nanokugeln 100 nm	ThermoScientific	3100A
Levamisol	Sigma	Nr. L-9756
Ausrüstung
Sorvall Legend XTR Kühlzentrifuge, 120VAC	ThermoScientific	75004521	http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60
96-poliger Replikator	Scionomix		http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro Inkubationsschüttler mit hoher Kapazität	Digilab		http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Kombi-Reagenzienspender	Titertrek		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automatisierte Workstation	Beckman Coulter		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 Schüttler	Neubraunschweig		http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389
M205 FA	Leica		http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigitale CCD-Kamera	Hamamatsu		http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Konfokales Spinning-Disc-AF-Mikroskop	Leica		http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 Kamera	Teledyne Dalsa		http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Mikroskopie-Automatisierungs- und Bildanalysesoftware	Molekulare Bauelemente		http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Bildanalyse-Software	Meyer Instrumente		http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
BildJ	Nih		http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck-Plugin für ImageJ			http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans-Stämme
N2 (WEA)	Caenorhabditis Genetikzentrum (CGC)		http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570

(möglicherweise in englischer Sprache)