Eine virale Vektorinjektion in die Substantia nigra der Ratte zur Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen

Zusammenfassung

Quelle: Van der Perren, A. et al., Entwicklung eines Alpha-Synuclein-basierten Rattenmodells für die Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektors.J. Vis. Exp.(2016).

Dieses Video zeigt den Prozess der Injektion eines viralen Vektors in die Substantia nigra der Ratte, um die Parkinson-Krankheit zu modellieren. Es werden die Schritte zur Vorbereitung der Ratte, zur Mikroinjektion des viralen Vektors in die Substantia nigra und das Wiederherstellungsverfahren beschrieben.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.

>1. Produktion und Reinigung rekombinanter Adeno-assoziierter Viren (rAAV)

Hinweis: Die Produktion und Reinigung von rAAV-Vektoren wurde vom Leuven Viral Vector Core (LVVC) durchgeführt.

1. Kurz gesagt, subkonfluente HEK 293T-Zellen mit niedrigem Durchgang (<50) unter Verwendung einer 25kD linearen Polyethylenimin 150 nM NaCl-Transfektionslösung und drei verschiedener Plasmide in einem Verhältnis von 1:1:1 in DMEM-Medium 2% fötalem Rinderserum transfizieren. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C bei 5 % CO₂ ist das Medium durch frisches DMEM-Medium mit 2 % fötalem Rinderserum zu ersetzen.
   Anmerkung: Zu den Plasmiden gehören die Konstrukte für den AAV7-Serotyp, das AAV-Transferplasmid, das für die humane A53T-Mutante alpha-Synuclein (α-SYN) unter der Kontrolle des CMVie-verstärkten Synapsin1-Promotors kodiert, und das adenovirale Helferplasmid pAdvDeltaF6.
2. Ernten Sie das Medium 5 Tage nach der transienten Transfektion und konzentrieren Sie es mit Tangentialflussfiltration.
3. Reinigen Sie die rAAV-Vektorpartikel aus dem konzentrierten Medium mit einem Iodixanol-Stufengradienten.
4. Verwenden Sie Standardtechniken der Echtzeit-PCR für die Bestimmung der genomischen Kopie (GC). In diesem Protokoll wurde ein Vektortiter von 3,0 E11 GC/ml verwendet, um ein α-SYN-basiertes Rattenmodell für die Parkinson-Krankheit (PD) zu entwickeln.

>2. Stereotaktische Injektion des rAAV α-SYN Vektors in die Substantia nigra (SN) der Ratte (Abbildung 1)

1. Halten Sie acht Wochen alte weibliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200-250 g unter einem normalen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu pelletiertem Futter und Leitungswasser.
2. Unterziehen Sie die Ratte einer intraperitonealen (i.p.) Anästhesie, die eine Mischung aus Ketamin (60 mg/kg) und Medetomidin (0,4 mg/kg) enthält. Sobald die Ratte betäubt ist und nicht reagiert, wenn sie die verschiedenen Pfoten zusammendrückt, verabreichen Sie der Ratte subkutan einen Mikrotransponder auf dem Rücken der Ratte, damit sie mit einem Mikro-Transponder-Implantator weiter erkannt werden kann. Prüfen Sie, ob der Mikrotransponder richtig positioniert ist und vom Lesegerät ausgelesen werden kann.
3. Schneiden Sie die Haare auf der Kopfhaut. Tragen Sie ein Lokalanästhetikum sowohl auf die Kopfhaut als auch auf die Ohren auf. Führen Sie den Rest des chirurgischen Eingriffs unter laminarer Strömung mit aseptischen Techniken durch.
4. Setze die Ratten mit zwei Ohrstangen, einem Mund und einer Nasenstange in ein stereotaktisches Kopfgerüst. Decken Sie den Körper der Ratte mit einer Papierdecke ab, um ein Absinken der Körpertemperatur zu vermeiden. Tragen Sie ein Augengleitmittel auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
5. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit Jodium 1% in Isopropanol 70% und machen Sie einen kleinen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut. Kratzen Sie die Membranen am Schädel vorsichtig ab und spülen Sie sie mit Kochsalzlösung ab. Lassen Sie den Schädel einige Minuten trocknen. Beobachten Sie die Schädelnähte und die beiden Referenzpunkte: Bregma und Lambda.
6. Um den rAAV-Vektor in die SN zu injizieren, definieren Sie die Koordinaten in Richtung Bregma (anteroposterior: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm; und dorsoventral: 7,2 mm, berechnet aus der Dura).
   Anmerkung: Die dreidimensionalen Koordinaten für jede Region of Interest können mit Hilfe eines stereotaktischen Atlas des Rattengehirns berechnet werden, wobei Bregma als anatomischer Bezugspunkt verwendet wird.
7. Füllen Sie eine 10-μl-Mikroinjektionsspritze (30 Gauge 20 mm) mit dem rAAV-Vektor und platzieren Sie ihn in das stereotaktische Instrument, das an eine motorisierte Mikroinjektionspumpe angeschlossen ist. Kontrollieren Sie das Volumen, indem Sie einen Tropfen Vektor freisetzen und in einem mehrwertigen Reinigungsmittel pH 9 (z. B. RBS) ausscheiden.
8. Prüfen Sie visuell, ob der Kopf gerade im Kopfrahmen fixiert ist, und bewerten Sie die Links-Rechts-Achse. Definieren Sie sorgfältig visuell die anteroposterioren und mediolateralen Koordinaten für Bregma und Lambda und messen Sie ihre Höhe mit einer 30-Gauge-Nadel von 20 mm im dorsoventralen Arm des stereotaktischen Rahmens.
   1. Erlauben Sie einen Höhenunterschied von maximal 0,3 mm zwischen Bregma und Lambda. Setzen Sie die Nadel wieder auf Bregma und wenden Sie die anteroposterioren und mediolateralen Koordinaten an, indem Sie den anteroposterioren und den mediolateralen Arm des stereotaktischen Rahmens bewegen.
9. Messen Sie an der Injektionsstelle die Höhe des Schädels und stellen Sie sicher, dass sie nicht mehr als 0,3 mm von der Höhe von Bregma abweicht. Bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von ca. 2 mm in den Schädel. Messen Sie die Höhe der Dura, die als Referenz für die Anwendung der dorsoventralen Koordinate dient. Alternativ können Sie eine feste Dicke für den Schädel (0,9 mm) abziehen.
10. Dringen Sie mit einer 26-Gauge-Nadel in die Dura ein und absorbieren Sie das Blut mit sterilem Gewebe. Warten Sie, bis alle Blutungen aufgehört haben, bevor Sie fortfahren.
11. Führen Sie die mit Vektorlösung vorgeladene 10-μl-Mikroinjektionsspritze langsam bis zur vorbestimmten Tiefe (dorsoventrale Koordinate) in das Gehirn ein. Warten Sie 1 Minute mit der Nadel an Ort und Stelle. Mit der motorisierten Mikroinjektionspumpe werden 3 μl Vektorlösung (3,0 E11-Genomkopien/ml (mittlere Vektordosis) oder 1,0 E12 GC/ml (hohe Vektordosis) rAAV2/7 α-SYN- oder eGFP-Kontrollvektor) mit der motorisierten Mikroinjektionspumpe injiziert.
12. Lassen Sie die Nadel nach der Injektion weitere 5 Minuten an Ort und Stelle, bevor Sie sie langsam entfernen. Nähen Sie die Kopfhaut mit beschichtetem geflochtenem Polyester 3.0, desinfizieren Sie mit 1 % Jodium in 70 % Isopropanol und nehmen Sie das Tier vorsichtig aus dem stereotaktischen Instrument. Lösen Sie zuerst den Nasen- und Mundbügel, dann die beiden Ohrbügel.
13. Um die Anästhesie rückgängig zu machen, injizieren Sie der Ratte intraperitoneal 0,5 mg/kg Atipamezol und setzen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig auf einer Heizplatte von 38 °C, bis sie aufwacht. Decken Sie die Ratte mit einer Papierdecke ab, um ein Absinken der Körpertemperatur zu verhindern.
14. Bieten Sie in den ersten Stunden einfachen Zugang zu Futter und Wasser. Überwachen Sie die Ratte in den ersten Tagen. Falls erforderlich, analgesie.
    Anmerkung: Es ist nicht notwendig, die Fäden vom Schädel zu entfernen. Nach 1-2 Wochen ist der Schädel vollständig repariert und die Fäden lösen sich.

Ergebnisse

Abbildung 1: Stereotaktische Injektion von rAAV2/7-Vektoren, die für α-SYN kodieren, in das SN der Ratte. (A, B, E) Die Schädelnähte am Rattenschädel, die die beiden Referenzpunkte definieren: Bregma und Lambda. (C) Ein stereotaktischer Atlas des Rattengehirns, der die Region der Injektion, nämlich die SN, darstellt. (D

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Weibliche 8 Wochen alte Wistar Ratten	Janvier		ca. 200-250 g
Ketamin (Nimatek)	Eurovet Tiergesundheit	804132
Medetomidin (Dormitor)	Orion-Pharma/ Janssen Animal Health	Tel.: 1070-499
Lokalanästhetikum für Kopfhaut und Ohren: Xylocaïne 2% Gel	Astrazeneca	Tel.: 0137-547
Terramycin	Pfizer	Tel.: 0132-472
Buprénorphin (Vetergesik)	Ecuphar	Tel.: 2623-627
Jodium 1% Isopropanol	VWR	Tel.: 0484-0100
stereotaktischer Förderrahmen	Stoeling
Hamilton Spritze (30 gauge -20mm -pst 2)	Hamilton/ Filterservice	7803-07
Atipamezol (Antisedan)	Orion-Pharma/Elanco	Nr. 1300-185
rAAV A53T α-SYN-Vektor	LVVC, KU Leuven		https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
DMEM, Glutamax	Lebenstechnologien	Nr. 31331-093
Fötales Rinderserum	Lebenstechnologien	Nr. 10270-106
25 kD lineares Polyethylenimin (PEI)	Polywissenschaften
OptiPrep Dichtegradient Medium: Iodixanol	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Lebenstechnologien	Nr. 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, vierte Auflage	Elsevier