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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Homogenisierung und Fraktionierung
- Auswahl des Gewebes
HINWEIS: Es wurden gefrorenes postmortales frontales Kortexgewebe aus gesunden Kontroll- (Ctl) und pathologisch bestätigten AD-Fällen ausgewählt (n=2). Die postmortale neuropathologische Bewertung der Amyloid-Plaque-Verteilung wurde gemäß den semiquantitativen Bewertungskriterien des Konsortiums zur Einrichtung eines Registers für die Alzheimer-Krankheit durchgeführt, obwohl die neurofibrilläre Tangle-Pathologie gemäß dem Braak-Staging-System bewertet wurde.
- Gewinnung von gefrorenem postmortalem Hirngewebe aus gesunden Kontroll- (Ctl) und pathologisch bestätigten Alzheimer-Fällen. Unter Verwendung von Behältern mit Trockeneis, Pinzetten und einer Rasierklinge werden ~ 250 mg Portionen grauer Substanz aus jeder Gewebeprobe auf tarierten Einweg-Wiegeschiffchen herausgeschnitten, wobei darauf zu achten ist, dass das Gewebe nicht auftaut. Notieren Sie das Gewicht jedes zu homogenisierenden Stücks.
- ~ 250 mg graue Substanz mit Pinzette und Rasiermesser durch visuelle Inspektion herausschneiden, um die Grenzfläche zwischen der äußeren grauen Substanz und der inneren weißen Substanz zu lokalisieren. Vermeiden Sie die weiße Substanz und vor allem große Blutgefäße oder blutige Regionen, Hirnhäute oder Arachnoidal. Halten Sie das Gewebe während des Schneidvorgangs gefroren, indem Sie schnell und häufig arbeiten und das Wiegeschiffchen mit Hirngewebe in Styroporbehälter mit Trockeneis legen.
- Notieren Sie das genaue Gewicht der grauen Substanz, die aus jedem gefrorenen Stück herausgeschnitten wurde, mit einer Analysenwaage. Berechnen Sie das Volumen des salzarmen (LS) Puffers (siehe Tabelle 1), das für die Dounce-Homogenisierung benötigt wird (5 mL/g oder 20 % w/v).
- 10 mL LS Puffer mit 1x Protease- und Phosphatasehemmer-Cocktail zubereiten und auf Eis kalt stellen.
- Nehmen Sie das gewogene Taschentuch und das Wiegeschiffchen aus dem Trockeneis und würfeln Sie es beim Auftauen in ca. 2 x 2 mm große Stücke. In ein vorgekühltes 2-ml-Dounce-Homogenisatorröhrchen auf Eis umfüllen.
- Fügen Sie 5 ml/g (20 % w/v) eiskalten Puffer mit niedrigem Salzgehalt (LS) mit 1X Protease und Phosphatasehemmer-Cocktail hinzu.
- Homogenisieren Sie das Gehirngewebe auf Eis mit etwa 10 Zügen Stößel A mit hoher Clearance und 15 Zügen Stößel B mit niedriger Clearance.
- Übertragen Sie das gesamte Homogenat mit einer Pasteur-Glaspipette in ein 2-ml-Polypropylenröhrchen. Markieren Sie das Röhrchen mit "TH" (Total Homogenate), der Gewebefallnummer und dem Homogenatvolumen. Aliquotieren Sie 0,8 mL in ein markiertes 1,5 mL-Röhrchen. Überschüssiges Homogenat kann auf ähnliche Weise aliquotiert und bei -80 °C gelagert werden.
- Zu jedem 0,8 ml-Aliquot werden je 100 μl 5 M NaCl und 10 % (w/v) Sarkosyl in Konzentrationen von 0,5 M bzw. 1 % w/v hinzugefügt. Die Röhrchen durch Inversion gut mischen und 15 min auf Eis inkubieren. Markieren Sie die Röhrchen mit "TH-S" (Gesamthomogenat-Sarkosyl), um anzuzeigen, dass die Homogenate in Sarkosylpuffer vorliegen (Tabelle 1).
- Beschallung jeder Röhre für drei 5 s Pulse bei 30 % Amplitude auf Eis (maximale Intensität = 40 %) mit einer Mikrospitzensonde.
- Die Proteinkonzentrationen der Homogenate sind mit der Bicinchoninsäure (BCA)-Assay-Methode zu bestimmen.
Anmerkung: Die durchschnittliche Proteinkonzentration von TH-S-Homogenaten, die mit 5 ml LS pro Gramm Gewebe hergestellt werden, beträgt 15-20 mg/ml. Die Homogenate können sofort fraktioniert oder bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert werden.
- Verdünnen Sie die TH-S-Homogenate auf 10 mg/ml unter Verwendung von eiskaltem Sark-Puffer (Tabelle 1) mit 1x Protease- und Phosphatase-Inhibitoren.
- 5 mg Protein (0,5 ml) jedes TH-S-Homogenats werden in 500 μl Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen überführt und mit Sark-Puffer paarausgeglichen. Die Röhrchen werden in einen vorgekühlten Rotor geladen und bei 180.000 x g für 30 min bei 4 °C ultrazentrifugiert. Die sarkosyllöslichen Überstände (S1) werden in 1,5 mL Röhrchen überführt und bei -80 °C gelagert< br />
HINWEIS: (Optionaler Waschgang) Geben Sie 200 μl Sark-Puffer in die Ultrazentrifugenröhrchen, die die waschmittelunlöslichen Fraktionen (P1) enthalten, und lösen Sie die Pellets (P1) mit einer 200-μl-Pipettenspitze vom Boden der Ultrazentrifugenröhrchen.
- Drehen Sie die invertierten Röhrchen kurz für 2-3 s (≤2.500 x g) auf einer Mikrozentrifuge, um das Granulat (P1) und den Puffer auf die darunter liegenden 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen. Resuspendieren Sie das unlösliche Pellet (P1) im Sark-Puffer, indem Sie auf und ab pipettieren, um sicherzustellen, dass das Pellet aufgebrochen wird.
- Paarweise ausbalancieren und bei 180.000 x g für weitere 30 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den optionalen Waschüberstand (S2) und inkubieren Sie das sarkosylunlösliche Granulat (P2) in 50-75 μl Harnstoffpuffer (Tabelle 1) mit 1x PIC (Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail) für 30 min bei Raumtemperatur, um das Pellet aufzulösen.
Anmerkung: Erwärmen Sie den Harnstoffpuffer vor der Verwendung auf Raumtemperatur, um SDS-Niederschläge zu vermeiden. Lassen Sie bei waschmittelempfindlichen Anwendungen SDS aus dem Harnstoffpuffer weg und erwägen Sie, das unlösliche Pellet (P2) in einem salzarmen Puffer zu waschen, bevor Sie es wieder in Harnstoffpuffer suspendieren.
- Übertragen Sie die resuspendierten Pellets (P2) in 0,5-ml-Röhrchen und verwenden Sie eine kurze (1 s) Mikrotip-Beschallung bei 20 % Amplitude (maximale Intensität = 40 %), um die Pellets vollständig aufzulösen.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen der sarkosyllöslichen (S1) und -unlöslichen (P2) Fraktionen mit der BCA-Assay-Methode. Verwenden Sie diese Fraktionen sofort oder lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -80 °C.
Tabelle 1: Liste der Puffer
| 10% w/v Sarkosyllösung: 10 g N-Lauryl-Sarcosin-Natriumsalz pro 100 ml ddH2O (über Nacht bei RT umrühren) |
| Puffer mit niedrigem Salzgehalt (LS): 50 mM HEPES pH 7,0, 250 mM Saccharose, 1 mM EDTA |
| Sarkosyl (Sark)-Puffer: LS-Puffer + 1 % (w/v) Sarkosyl + 0,5 M NaCl |
| Harnstoffpuffer (bei -20 °C lagern): 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 8M Harnstoff, 2% SDS |