Bewertung der motorischen Funktion in einem experimentellen Mausmodell für Autoimmunneuritis

Abstract

Quelle: Gonsalvez, D. G., et al., Ein einfacher Ansatz zur Induktion experimenteller Autoimmunneuritis bei C57BL/6-Mäusen für funktionelle und neuropathologische Beurteilungen. J. Vis. (2017).

Dieses Video zeigt den Prozess der Beurteilung der motorischen Dysfunktion in einem Mausmodell durch die Verabreichung von Pertussis-Toxin und einem Inokulum, das Myelin-imitierende Peptide und Adjuvantien enthält, gefolgt von Laufbandtests, um die motorische Funktion zu beurteilen und die daraus resultierenden Nervenschäden aufgrund von Immunaktivierung und Demyelinisierung zu bewerten.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. EAN (Experimentelle Autoimmunneuritis) Induktion

HINWEIS: EAN kann bei männlichen C57BL/6-Mäusen im Alter zwischen 6 und 8 Wochen erfolgreich induziert werden. Das Induktionsprotokoll dauert insgesamt 9 Tage. Tag 0 bezieht sich auf den Tag der ersten Immunisierung. Für dieses Protokoll wurden Injektionen unter Narkose durchgeführt (siehe Schritt 1.1.2 unten).

1. An Tag -1:
   1. Bereiten Sie die Pertussis-Toxin-Lösung (siehe Materialtabelle) mit 1,6 μg/ml unter Verwendung von steriler 0,1 M Maus-isotonischer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (MT-PBS) vor.
   2. Anästhesie mit Isofluran:
      1. Legen Sie die Maus (C57BL/6, männlich, 6-8 Wochen) in die Anästhesiekammer und stellen Sie den Sauerstofffluss auf 1 L/min ein.
      2. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer ein, stellen Sie ihn für die Anästhesie auf 2,5 % ein, überwachen Sie die Atmung und warten Sie 2 Minuten oder bis die primären Reflexe (Hornhaut und Hintergliedmaßen) nicht mehr reagieren.
   3. Nehmen Sie die Maus aus der Anästhesiekammer und verabreichen Sie 250 μl der oben genannten Pertussis-Toxin-Lösung über eine intraperitoneale (i.p.) Injektion mit einer 0,5-ml-Spritze und einer 30_1/2 G-Nadel.
   4. Bereiten Sie das injizierbare Inokulum für die Immunisierung vor:
      1. Lösung A mit 2 mg/ml Lösung des Peptids P0180-199 (mit > Reinheit von 98 %, Sequenz S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in 0,9 % Kochsalzlösung herstellen.
      2. Lösung B wird mit einer 20 mg/ml-Lösung von Mycobacterium tuberculosis (siehe Materialtabelle) in Freunds vollständigem Adjuvans (FCA, bestehend aus 15 % Mannidmonoolat + 85 % Paraffinöl und 0,5 mg/ml getrocknetem, abgetötetem und getrocknetem Mycobacterium butyricum) hergestellt.
      3. Um das endgültige Inokulum für die Injektion herzustellen, kombinieren Sie gleiche Volumenteile der Lösungen A und B in einem Rührbesen und mischen Sie sie bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur.
         Anmerkung: Die Lösungen A und B können als Vorrat aufbewahrt und maximal einen Monat lang bei 4 °C gelagert werden, aber das kombinierte endgültige Inokulum muss am Tag der Mausinjektion frisch zubereitet werden.
2. An Tag 0 werden einer Maus 50 μl des Inokulums (Präparat in Schritt 1.1.4 beschrieben) durch subkutane Injektion mit einer 23-G-Nadel verabreicht.
   Anmerkung: Die Injektion kann zwischen den Schulterblättern oder zwischen der hinteren Extremität und dem Schwanz über dem kaudalen Rücken platziert werden.
3. Stellen Sie an Tag 1 die Pertussis Toxin-Lösung von 1,2 μg/ml (in MT-PBS) her und verabreichen Sie einer Maus 250 μl per i.p. Injektion mit einer 0,5 ml-Spritze und einer 301/2 G-Nadel.
4. Wiederholen Sie an Tag 3 Schritt 1.3 oben.
   Anmerkung: Die Stammlösungen A und B können konfektioniert und bei 4 °C für maximal einen Monat gelagert werden. Das endgültige injizierbare Inokulum, das durch die Kombination der Stammlösungen A und B hergestellt wird, muss jedoch am Tag der Injektion erfolgen.
5. An Tag 8 werden einer Maus 50 μl des Inokulums (Zubereitung gemäß Schritt 1.1.4) durch subkutane Injektion (siehe Schritt 1.2 oben) an derselben Injektionsstelle wie in Schritt 1.2 (für jedes Tier) verabreicht

>2. Bewertung der Motorik

HINWEIS: Die motorische Leistung wird parallel zur klinischen Bewertung für die gleiche Kohorte von Tieren bewertet. Das Gerät zur Beurteilung der motorischen Funktion muss an einen Computer angeschlossen werden, auf dem ein Bildgebungssystem für die Gangfunktion installiert ist (siehe Materialtabelle). Es wird auch empfohlen, dass alle zu beurteilenden Mäuse vor der EAN-Induktion an die laufende Aufgabe gewöhnt werden. Dazu werden drei Tage vor der Krankheitseinleitung (Tag -3) Übungsläufe (2 Testläufe pro Maus) durchgeführt.

1. Schalten Sie das Gerät zur Bewertung der Motorfunktion ein und schalten Sie die Lichttaste ein.
2. Ziehen Sie die Maus fest an und färben Sie ihre Füße ein, indem Sie sie auf einen mit roter Tinte gefüllten Behälter absenken, während Sie den Schwanz festhalten.
   Anmerkung: Dieser Schritt ist für den Stamm C57BL/6 erforderlich, kann aber übersprungen werden, wenn ein Mausstamm mit einer weißen Fellfarbe verwendet wird.
3. Setzen Sie die Maus in das Gehfach ein und stellen Sie die Laufbandgeschwindigkeit auf 15 cm/s ein.
4. Schalten Sie das Laufband ein und klicken Sie auf die Aufnahmetaste, um die Laufbewegung der Maus mit dem Bildgebungssystem der Gangfunktion zu erfassen (siehe Materialtabelle).
5. Verwenden Sie einen Timer und messen Sie jeden Lauf für 36 s. Stoppen Sie nach 36 s die Aufnahme und stoppen Sie das Laufband.
   Anmerkung: Mäuse, die die ausgeführte Aufgabe in diesem Intervall von 36 s nicht erfolgreich abschließen können, gelten als fehlgeschlagen.
6. Speichern Sie die Videodatei im angegebenen Ordner.
7. Wiederholen Sie die obigen Schritte für jede Maus, die bewertet werden soll. Testen Sie die Mäuse alle 3 Tage mit der gleichen Laufaufgabe.
8. Analysieren Sie die bearbeiteten Videodateien mit einer Software für die Parameter der Gangfunktion (siehe Materialtabelle).
   Anmerkung: Die Details zur Analyse verschiedener Motorparameter variieren je nach Software, daher lesen Sie bitte vor der Analyse die Anweisungen des Herstellers. Abhängig von den spezifischen Zielen der Forschung können tierische Gewebe in jedem Stadium der postmotorischen Funktionsbeurteilung entnommen werden, um histologische Beweise für Axon- und Myelinschäden entweder durch Immunhistochemie oder Elektronenmikroskopie zu erhalten.

Results

Tabelle 1: EAN klinisches Score-Paradigma.

Punktzahl	Kriterien	Hinweise und Anmerkungen zu den Beurteilungskriterien
0	Normale Maus
1	Weniger lebendiger OP-Schaum	Dies wird als Rea...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, männlich, 6-8 Wochen alt	Australische Bioressourcen Cenre, WA, Australien
Pertussis-Toxin	Liste Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0,1 M Maus-isotonische phosphatierte gepufferte Kochsalzlösung (MT-PBS)			Die Labore werden ihr eigenes Protokoll haben.
Isofluran	Pharmachem, QLD, Australien		Die Laboratorien werden ihr eigenes Protokoll für die Verabreichung haben.
P0180–199 Peptid	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, Sequenz S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Hitzeabgetötetes Mycobacterium tuberculosis (Stamm H37RA)	Difco, MI, Vereinigte Staaten Von Amerika	#231141
Freund's vollständiges Adjuvans (FCA)	Difco, MI, Vereinigte Staaten Von Amerika	#263910
16 % Paraformaldehyd (PFA)	Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie	#15710	Am Tag der Gewebeentnahme auf 4 % PFA verdünnen.
25% Glutaraldheyd	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australien	#11-30-8	Am Tag der Fixierung auf 2,5 % Glutaraldehyd verdünnen.
Natriumazid	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australien	SL189	Erstellen Sie 10% (w/v) Lagerbestand in 0,1 MIO. MT-PBS. Bei 0,03 % (v/v) verwenden.
Saccharose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australien	SA030	Bei 30% (w/v) verwenden.
Optimale Schnitttemperatur (OCT) mittel	Sakura Finetek, Kalifornien, Vereinigte Staaten Von Amerika	#4583
Normales Eselserum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Verwendung als Antikörperverdünnungsmittel bei 10% (v/v) oder einer anderen Konzentration, die vom eigenen Labor bestimmt wurde.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, Vereinigte Staaten von Amerika	#90o2-31-1	Verwendung in Antikörperverdünnungsmitteln in einer Dosis von 0,3 % (v/v) oder einer anderen Konzentration, die vom eigenen Labor bestimmt wurde.
Kaninchen-Anti-Amyloid-Vorläuferprotein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	Nr. S12700	Wird bei 1:400 verwendet oder titriert im eigenen Labor.
Kaninchen Anti-Contactin-assoziiertes Protein-1 (Caspr)	Geschenk von Prof. Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Wird bei 1:500 verwendet oder titriert im eigenen Labor.
Geeignete Alexa Fluor konjugierte Sekundärantikörper	Molekulare Sonden (Life Technologies), OR, USA	verschieden	Bei 1:200 verwenden oder im eigenen Labor titrieren. Die Wahl der Spezies, in der der Antikörper gezüchtet wurde, und der Wahl von Alexa Fluor liegt im Ermessen des jeweiligen Labors.
Wässrige Einbettlösung	Dako (Agilent), CA, Vereinigte Staaten von Amerika	#S3023	Jedes Labor hat seine eigenen Vorlieben.
Ausrüstung
0,5 mL Spritze mit 301/2 g Nadeln	Bd	#326105
23 g Nadeln	Bd	#305143
Rotes Stempelkissen			Jedes rote Stempelkissen oder jede rote Lebensmittelfarbe könnte verwendet werden, um die Füße der Tiere zu markieren.
DigiGate-Gerät (einschließlich Laufband)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Bildgebungssystem	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stoppuhr			Es kann ein beliebiger Timer verwendet werden.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Präpariermikroskop	Zeiss		Jedes geeignete Präpariermikroskop kann verwendet werden.
Aufgeladene Folien	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Es kann jedes geeignete Cyrostat verwendet werden.
Perfusionsgeräte und Präparierinstrumente			Die Labore werden ihre eigenen Perfusionsprotoktole haben.
Undurchsichtige humifizierte Kammer			Labore können ihre eigenen mit einem undurchsichtigen Kunststoffbehälter herstellen.
PAP Pen	GeneTex (USA)		Ein Wachsstift oder Oberflächenspannung können auch verwendet werden, um eine Vertiefung um den Gewebeschnitt zu erstellen.
Konfokales Mikroskop	Zeis LSM780		Es kann jedes konfokale Mikroskop mit entsprechenden Laserlinien verwendet werden.
FIJI/Bild J	Nationale Gesundheitsinstitutionen		Verfügbar ab www.fiji.sc