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Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in gentechnisch veränderten Drosophila-Gehirnen

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Donnelly, K. M., et al. Überwachung der Zell-zu-Zell-Übertragung von Prionen-ähnlichen Proteinaggregaten in Drosophila melanogaster. J. Vis. (2018)

Dieses Video zeigt die Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in genetisch veränderten Drosophila-Gehirnen. Das Gehirn wird fixiert, gewaschen und mit einem Antifading-Mittel behandelt, bevor es montiert wird. Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen und quantifiziert, um die Übertragung mutierter Proteinaggregate zu beobachten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

>1. Kopplung der Gal4- und QF-vermittelten Htt-Transgenexpression in Drosophila

  1. Sammeln und/oder generieren Sie transgene Drosophila melanogaster-Linien, die gewebespezifische Gal4- oder QF-"Treiber" enthalten, sowie Linien, die Wildtyp- oder mutierte Htt-Transgene stromabwärts von Gal4-UAS oder QF-QUAS enthalten. Stellen Sie sicher, dass die Proteine, die von diesen Transgenen exprimiert werden, mit fluoreszierenden Proteinen fusioniert oder mit Epitopen markiert sind, um die Differenzierung von mutierten und Wildtyp-Htt-Transgenprodukten in ein und derselben Fliege zu ermöglichen. Siehe Abbildung 1.
    HINWEIS:     Wir ve....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

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Abbildung 1. Ein genetischer Ansatz zur gekoppelten Expression von mutierten und Wildtyp-Htt-Transgenen unter Verwendung der binären Expressionssysteme QF-QUAS und Gal4-UAS. In "Zelle A" wird das mCherry-markierte mutierte Htt-Protein, das einen pathogenen PolyQ-Abschnitt (Q91) enthält, mit einem QF-Treiber exprimiert, der sich stromabwärts eines gewebespezifischen Promotors A ("PA") befindet. In .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10X, pH 7,4ThermoFisher ScientificAM9625Auf 1X verdünnen
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-1L
KimwipesThomas WissenschaftlichArtikel-Nr.: 2904F24
20 % Paraformaldehyd (PFA)Elektronenmikroskopie15713-S
Normales Ziegenserum (NGS), gefiltertLampire Biologische LaboratorienArtikel-Nr.: 7332500Aliquotieren und bei Erhalt einfrieren
Anti-GFP für HühnchenAves LabsGFP-1020Bei einer Verdünnung von 1:500 verwenden
Kaninchen Anti-DsRedClontech632496Verwendung in einer Verdünnung von 1:2000; kann fluoreszierende Proteine auf DsRed-Basis erkennen (z. B. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Maus Anti-BruchpilotEntwicklungsstudien Hybridom-BankNC82Bei einer Verdünnung von 1:100 verwenden; markiert aktive präsynaptische Strukturen im gesamten Fliegengehirn
FITC Anti-HühnerfleischThermoFisher ScientificSA1-7200Verwendung bei einer Verdünnung von 1:250
Alexa Fluor 568 Anti-KaninchenLebenstechnologienNr. A11011Verwendung bei einer Verdünnung von 1:250
Alexa Fluor 647 Anti-Maus-AntikörperLebenstechnologienNr. A21235Verwendung bei einer Verdünnung von 1:250
Slowfade Gold Antifade ReagenzLebenstechnologienNr. S36936
Objektträger (25 x 75 x 1,0 mm)Fisher ScientificTel.: 12-550-143
Deckglas (22 x 22 mm)Globus WissenschaftlichNr. 1404-15
Dumont Pinzette für Biologie, Typ 3Ted PellaNr. 503Verwendung in nicht-dominanter Hand
Dumont Pinzette in Biologiequalität, Typ 5Ted Pella505Verwendung in dominanter Hand
LAS X BildanalysesoftwareLeica
Imaris BildanalysesoftwareBitplane
kg

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Protein AggregatesDrosophila BrainsConfocal MicroscopyImage QuantificationFluorescent TaggingCo localization AnalysisFixative SolutionAntifade ReagentZ stack ImagingMutant Protein

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