>1. Kopplung der Gal4- und QF-vermittelten Htt-Transgenexpression in Drosophila
- Sammeln und/oder generieren Sie transgene Drosophila melanogaster-Linien, die gewebespezifische Gal4- oder QF-"Treiber" enthalten, sowie Linien, die Wildtyp- oder mutierte Htt-Transgene stromabwärts von Gal4-UAS oder QF-QUAS enthalten. Stellen Sie sicher, dass die Proteine, die von diesen Transgenen exprimiert werden, mit fluoreszierenden Proteinen fusioniert oder mit Epitopen markiert sind, um die Differenzierung von mutierten und Wildtyp-Htt-Transgenprodukten in ein und derselben Fliege zu ermöglichen. Siehe Abbildung 1.
HINWEIS: Wir verwenden in der Regel Exon-1-Fragmente des menschlichen Htt-Gens. Es können jedoch auch transgene Fliegen erzeugt werden, um auf Wunsch längere Htt-Fragmente oder andere Gene zu exprimieren.
- Planen Sie die genetische Strategie so, dass mutierte und Wildtyp-Htt-Transgene in unterschiedlichen, nicht überlappenden Zellpopulationen exprimiert werden.
- Wenn es zu einer Expressionsüberlappung kommt, koaggregieren mutierte und Wildtyp-Htt-Proteine, die in denselben Zellen synthetisiert werden, und verhindern den Nachweis von Prionen-ähnlichen Ereignissen. Um dies zu vermeiden, verwenden Sie die Gal4- und QF-spezifischen Repressoren Gal80 bzw. QS40 (Abbildung 1). Die Auswahl von entwicklungskontrollierten Gal4- und/oder QF-Treibern kann dazu beitragen, die Expression von mutiertem Htt auf postmitotische Zellen zu beschränken, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass die Zellteilung zur Ausbreitung des Aggregats von Zelle zu Zelle beitragen könnte.
- Unter Verwendung von Standard-Kultivierungsbedingungen paaren Sie die Fliegen, um Nachkommen zu erzeugen, die mutiertes Htt über QF (oder Gal4) in einer "Donor"-Zellpopulation und Wildtyp-Htt über Gal4 (oder QF) in einer "Empfänger"-Zellpopulation exprimieren. In Abbildung 1 sehen Sie ein Schema, das eine mögliche genetische Kombination zeigt.
Anmerkung: Zu den QF- und Gal4-Treibern, die zur Generierung der in den Abbildungen 1-4 und in unserer vorherigen Veröffentlichung gezeigten Daten verwendet wurden, gehören der DA1-Geruchsrezeptor-Neuron (ORN)-Treiber, Or67d-QF, und der Panglia-Treiber, repo-Gal4.
- Generieren Sie parallel Kontrollfliegen, die Wildtyp-Htt sowohl in QF- als auch in Gal4-markierten Zellpopulationen exprimieren.
- Entnahme von Nachkommen des gewünschten Genotyps und Alterung der Tiere nach Bedarf.
>2. Mikrodissektion und Fixierung von adulten Drosophila-Gehirnen
HINWEIS: Dieses Dissektionsverfahren wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung modifiziert und kann verwendet werden, um Gehirne für die Abbildung direkter Fluoreszenzsignale von Htt-fluoreszierenden Proteinfusionen vorzubereiten.
- Folgende Materialien werden gesammelt und auf Eis gelegt: phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,03 % Triton X-100 (PBS/T); Mikrozentrifugenröhrchen mit 970 μl 4 %iger Paraformaldehyd (PFA)-Fixierlösung, hergestellt durch Zugabe von 200 μl 20 % PFA zu 770 μL PBS/T; eine Klarglasschale mit Vertiefung; eine Einweg-Transferpipette; zwei Präparierzangen (eine Nr. 3 und eine Nr. 5).
- Betäuben Sie die erwachsenen Fliegen mit CO2 und geben Sie sie in eine Vertiefung der Glasschale auf Eis.
- Geben Sie mit einer Transferpipette eine kleine Menge (~ 500 μl) kaltes PBS/T in die Vertiefung, die die Fliegen enthält, und in eine leere Vertiefung. Vermeiden Sie es, zu viele Blasen einzuführen, da diese die Dissektion beeinträchtigen können.
- Stellen Sie die Glasschale auf eine ebene Fläche unter ein Präpariermikroskop und stellen Sie die Vergrößerung so ein, dass der Fliegenkörper das Sichtfeld ausfüllt und scharf ist.
- Positionieren Sie ein Paar Schwanenhals-Lichtquellen so, dass das Licht beide Seiten der Glasschale beleuchtet. Verankern Sie ein gefaltetes Laborgewebe unter der Glasschale, um Körperteile/Nagelhaut während der Dissektion zu entsorgen.
- Mit der Pinzette Nr. 3 in der nicht-dominanten Hand eine einzelne Fliege in die Vertiefung mit PBS/T einführen. Immobilisieren Sie die Fliege, indem Sie ihren Bauch mit der Bauchseite nach oben greifen.
- Halten Sie die Fliege vollständig in PBS/T eingetaucht und entfernen Sie den Fliegenkopf mit der Pinzette Nr. 5 in der dominanten Hand. Führen Sie eine Spitze dieser Pinzette unter der Nagelhaut in den kleinen Raum neben dem Rüssel auf einer Seite des Fliegenkopfes ein. Sichern Sie den Griff am Kopf, indem Sie die Pinzette einklemmen, um das Auge von beiden Seiten zu greifen.
- Entferne den Fliegenkopf von seinem Körper, indem du die beiden Pinzetten auseinanderziehst. Entsorgen Sie den Fliegenkörper auf einem Labortuch in der Nähe. Halten Sie den Druck auf die Pinzette der dominanten Hand aufrecht, damit der Fliegenkopf nicht verloren geht.
- Positionieren Sie eine Spitze der Pinzette Nr. 3 in der nicht dominanten Hand im gleichen kleinen Raum unter der Nagelhaut auf der anderen Seite des Rüssels. Sobald sie positioniert ist, kneifen Sie die Pinzette zusammen, um die Augen an beiden Seiten des Kopfes an der gleichen Stelle zu greifen.
- Sobald der Griff an der Nagelhaut fest sitzt, ziehen Sie die Pinzette vorsichtig um 180° auseinander. Diese Aktion bricht die Nagelhaut des Kopfes auseinander, ohne das Gehirn zu schädigen. Entsorgen Sie Nagelhautreste auf einem Laborgewebe.
- Obwohl ideal, kann die Nagelhaut des Kopfes nicht in einem Schritt vollständig entfernt werden. Entfernen Sie in diesem Fall die Nagelhaut Stück für Stück, bis das Gehirn vollständig freigelegt ist. Achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu schädigen, indem Sie den direkten Kontakt mit der Pinzette vermeiden.
- Entfernen Sie das präparierte Gehirn aus dem PBS/T, indem Sie entweder eine befestigte Luftröhre greifen oder das Gehirn durch Kapillarwirkung in den Raum zwischen den Pinzettenspitzen aspirieren.
Anmerkung: Die Entfernung der Luftröhre ist optional, da sie dazu neigt, die Antennenlappen auf der vorderen Oberfläche des Gehirns, wo wir normalerweise abbilden, nicht zu verdecken. Wenn die Luftröhre jedoch die Bildgebung beeinträchtigt, entfernen Sie sie vorsichtig, damit das Gehirn durch diese Manipulation nicht geschädigt wird.
- Übertragen Sie das Fliegengehirn in eines der Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Fixierlösung auf Eis. Stellen Sie sicher, dass sich das Gehirn von der Pinzette löst und in die Fixierlösung eingetaucht wird.
- Sobald alle Gehirne präpariert sind, unterziehen Sie sie einem "Short-Fix", indem Sie die geschlossenen Röhrchen für ~ 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einen Nährstoffator legen.
HINWEIS: Dieser kurze Fixierungsschritt stellt sicher, dass das Gehirn in den nachfolgenden Schritten leichter zu handhaben ist und nicht an den Seiten des Mikrozentrifugenröhrchens haftet.
- Entfernen Sie den größten Teil der Fixierlösung mit einer P1000-Pipette und entsorgen Sie sie.
- Vermeiden Sie es, während dieses und aller nachfolgenden Waschschritte Gehirne aus der Tube zu aspirieren. Stellen Sie den P1000 auf ein niedrigeres Volumen (z. B. 650 μL) ein und entfernen Sie den Überstand in zwei Schritten. Halten Sie außerdem die Mikrozentrifugenröhrchen während des Aspirierens in einer Linie mit einer Lichtquelle (z. B. Deckenleuchten), um das Gehirn besser sichtbar zu machen.
- Geben Sie 1 ml frisches PBS/T in das Gehirn. Schnell (< 1 min) im Dunkeln waschen, den Überstand aus dem Gehirn absaugen und entsorgen.
- Wiederholen Sie das Waschen mit PBS/T im Dunkeln bei Raumtemperatur nach folgendem Zeitplan: 2 schnelle (< 1 min) Wäschen, 1 x 5 min, 3 x 20 min und 1 x 1 h Wäsche. Befestigen Sie die Verschlüsse auf Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie die Röhrchen zwischen den Wäschen auf einen Nährstoffator.
- Wenn eine DAPI-Färbung gewünscht wird, ersetzen Sie die letzte 1-stündige Wäsche durch 1 x 30-minütige Inkubation mit 250 ng/mL DAPI, verdünnt in PBS/T, gefolgt von 2 x schnellen und 1 x 20-minütigen Wäschen.
- Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den größten Teil des Überstands des Waschpuffers, achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu stören, und geben Sie 30 μl Antifading-Reagenz auf Glycerinbasis in das Gehirn. Bei 4 °C im Dunkeln ohne Bewegung für mindestens 1 h und bis zu 24 h inkubieren.
>3. Montage des ganzen Gehirns
- Legen Sie einen Objektträger aus Glas unter ein Präpariermikroskop und beschriften Sie ihn mit Identifikationsinformationen.
HINWEIS: Alternativ können die Gehirne direkt auf ein Deckglas montiert werden, um während der Bildgebung Zugang zu beiden Seiten des Gehirns zu erhalten. Ein Protokoll, das dieses Montageverfahren beschreibt, wurde bereits veröffentlicht45.
- Entfernen Sie die Gehirne mit einer abgestumpften Pipettenspitze aus jedem Mikrozentrifugenröhrchen (mit einer Rasierklinge vorbereitet, um den Boden ~ 1 cm von einer 1-200 μL-Spitze zu entfernen) und übertragen Sie sie in die Mitte des Objektträgers. Übertragen Sie so wenig Antifading-Reagenz wie möglich mit dem Gehirn.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gehirn in der gewünschten Ausrichtung zu positionieren (z. B. dorsal zeigt zur Oberseite des Objektträgers und die vordere Fläche zeigt nach oben, um den Antennenlappen abzubilden). Berücksichtigen Sie bei der Ausrichtung des Gehirns den Strahlengang des Mikroskops, das für die Abbildung verwendet werden soll.
- Entfernen Sie überschüssiges Antifading-Reagenz mit der spitzen Ecke eines gefalteten Laborgewebes vom Objektträger, ohne das Gehirn zu stören. Lassen Sie die Folie ~ 5-10 Minuten im Dunkeln ruhen, damit das Gehirn an der Folie haften kann.
- Umgeben Sie die Fliegengehirne mit vier kleinen Stücken zerbrochenem Deckglas, die auf jeder Seite des Gehirns platziert werden, um ein Quadrat von ~ 19 mm x 19 mm zu bilden. Platzieren Sie eine Kante eines 22 mm x 22 mm großen Abdeckglases Nr. 1,5 direkt außerhalb eines dieser kleinen Glasstücke und senken Sie das Deckglas vorsichtig über die Gehirne, um die Brückenhalterung zu vervollständigen.
- Geben Sie langsam frisches Antifading-Reagenz auf, um die Oberfläche unter dem Deckglas zu füllen, und achten Sie darauf, das Deckglas oder das Gehirn nicht zu stören. Wischen Sie überschüssiges Antifading mit der spitzen Ecke eines gefalteten Laborgewebes ab, ohne das Deckglas direkt zu berühren.
- Geben Sie einen Tropfen klaren, schnell trocknenden Nagellack auf jede der vier Ecken des Deckglases. ~ 10 min trocknen lassen. Versiegeln Sie dann die vier Kanten des Deckglases mit Nagellack, um das Gehirn vollständig zu umschließen.
- Bilden Sie das Gehirn sofort ab oder lagern Sie es bei 4 °C, bis es fertig ist.
- Wenn Sie die intrinsische Fluoreszenz aus Htt-fluoreszierenden Proteinfusionen abbilden, bilden Sie das Gehirn innerhalb von 24 Stunden ab, um das beste Signal zu erhalten.
>4. Abbildung und Quantifizierung der prionenartigen Übertragung von Aggregaten
- Nehmen Sie die montierten Gehirne mit einem konfokalen Mikroskop ab, das mit einem 40X- oder 60/63X-Ölobjektiv ausgestattet ist, um Z-Slice-Bilder durch den Bereich des Gehirns zu sammeln, in dem die ausgewählten Gal4- und QF-Treiber exprimiert werden (Abbildung 2A, B).
- Stimulieren Sie die fluoreszierenden Proteinfusionen oder immunmarkierten Proteine mit den entsprechenden Lasern (z. B. 488 nm für GFP/YFP/FITC oder 552 nm für mCherry/Cy3). Legen Sie Detektionsfenster fest, die ein maximales Fluoreszenzsignal erfassen und gleichzeitig das Übersprechen der Kanäle eliminieren, indem Sie entweder ein spektrales Detektionssystem oder Band-/Langpass-Emissionsfilter verwenden, die für jedes Fluorophor spezifisch sind.
HINWEIS: Seien Sie aufmerksam, wenn Sie Proteinaggregate abbilden. Es ist leicht, dass Pixel in der Mitte jedes Aggregats gesättigt werden, insbesondere bei größeren Aggregaten. Versuchen Sie, die Sättigung im Bild zu minimieren, aber seien Sie sich des Risikos bewusst, dass das Signal kleinerer aggregierter Spezies verloren geht (Abbildung 2B, C, D). Zu viel Sättigung vergrößert den Bildhintergrund, wodurch es schwieriger wird, isolierte Puncta zu identifizieren. Testen Sie verschiedene Bildgebungseinstellungen, um sie zu optimieren, bevor Sie die endgültigen Bilder in jedem Datensatz aufnehmen.
- Analysieren Sie die Daten, indem Sie einzelne Punkte quantifizieren, indem Sie sich entweder manuell durch einzelne Z-Schichten bewegen (z. B. Abbildung 2C und Abbildung 4A) oder nachdem Sie die konfokalen Schichten in 3 Dimensionen gerendert haben (Abbildung 3A, B).
Anmerkung: Dies kann in Image J oder einer anderen Bildverarbeitungssoftware erfolgen.
- Wenn die Aggregate gut getrennt sind und die Hintergrundfluoreszenz minimal ist, verwenden Sie eine Bildanalysesoftware, um die Aggregate in einer 3D-Rekonstruktion des konfokalen Stapels systematisch als unterschiedliche "Objekte" oder "Oberflächen" zu identifizieren, zu quantifizieren und zu analysieren (Abbildung 3B).
Anmerkung: Die beschriebenen Softwareaktionen sind spezifisch für das hier verwendete Gerät und die Software (siehe Materialtabelle).
- Visualisieren Sie eine konfokale Z-Serie im 3D-Ansichtsmodus. Verwenden Sie den "Analyse"-Assistenten, um einzelne Punkte in einem ausgewählten Kanal zu identifizieren (z. B. den roten Kanal für HttQ91-mCherry-Aggregate in Abbildung 3). Passen Sie die Schwellenwerte und Filter an, um alle Aggregate heterogener Größe als einzelne Objekte im Bild genau darzustellen.
- Aktivieren Sie "Objekte aufteilen" unter "Binary Processing Pre-Filter", um eng verbundene Aggregate zu trennen, die vom Softwarealgorithmus fälschlicherweise zusammengeführt werden. Beachten Sie, dass die Gesamtzahl der Objekte und der zugehörigen Messungen unter "Messungen" aufgeführt wird
Anmerkung: Diese Methode zur Quantifizierung mutierter Htt-Aggregate ist für das Immunfärbeprotokoll nicht zugänglich, da das Zentrum der Amyloid-Aggregate für Antikörper undurchdringlich ist. Das hat zur Folge, dass die Aggregate am Mikroskop als ringförmige Strukturen erscheinen und eine Bildanalysesoftware nicht in der Lage ist, diese einzelnen "Flecken" genau zu identifizieren und zu unterscheiden.
- Quantifizieren Sie Htt-Aggregate vom Wildtyp, indem Sie sich manuell durch den Z-Stapel bewegen und Htt-Aggregate vom Wildtyp bewerten, um sicherzustellen, dass keine Aggregate doppelt bewertet werden, wenn sie in mehr als einem Slice vorkommen (Abbildung 4A).
Anmerkung: Dieser manuelle Quantifizierungsansatz kann verwendet werden, wenn die Anzahl der Aggregate in jedem konfokalen Stapel angemessen ist (z. B. 20-50). Es ist auch hilfreich, wenn Bildanalysesoftware einzelne Punkte nicht von dem umgebenden Signal im selben Kanal unterscheiden kann (z. B. das Signal von diffusem Wildtyp-Htt in benachbarten Zellen) (Abbildung 2B, C und Abbildung 4A). Die Quantifizierung von Wildtyp-Htt-Aggregaten kann ebenfalls eine Herausforderung darstellen, da viele normale Strukturen im Gehirn punktförmig erscheinen (z. B. Zellfortsätze und Synapsen). Als Auswahlkriterium kann die Co-Lokalisierung von Wildtyp- und mutierten Htt-Signalen herangezogen werden; Es ist jedoch möglich, dass einige mutierte Htt-"Samen" unter die Nachweisgrenze des Kondocals fallen. Ein anderes Protein als Htt, das nicht in den Empfängerzellen aggregiert (z. B. GFP), kann verwendet werden, um nicht verwandte punktförmige Strukturen im Gehirn zu markieren.
- Verwenden Sie Bildanalysesoftware, um eine weitere Charakterisierung einzelner Aggregate durchzuführen. Bestimmen Sie beispielsweise die Größenverteilung der Aggregate (Abbildung 3C), die prozentuale Kolokalisation zwischen mutierten und Wildtyp-Htt-Proteinen (Abbildung 4A) oder messen Sie direkt Protein-Protein-Wechselwirkungen mit FRET (Abbildung 4B).
- Bestimmen Sie die Größenverteilung einzelner Punktzahlen mit einem Punkt- oder Oberflächenerkennungsalgorithmus, der alle sichtbaren Aggregate in einem bestimmten Kanal genau identifiziert. Verwenden Sie die Bildanalysesoftware, um relevante Messungen der Flecken oder Oberflächen vorzunehmen, z. B. um Informationen über den Gesamtdurchmesser (Abb. 3C), das Volumen oder die Intensität aus "Messungen" im Software-Assistenten "Analyse" zu erhalten, der in Schritt 4.2.1.
beschrieben ist.
Anmerkung: In Abbildung 3C zeigen wir die Verteilung der Durchmesser für alle HttQ91-mCherry-Puncta, die in einem einzelnen DA1-Glomerulus identifiziert wurden.
- Bestimmen Sie die prozentuale Co-Lokalisierung zwischen HttQ25-YFP- und HttQ91-mCherry-Aggregaten, indem Sie manuell Schicht für Schicht durch einen konfokalen Z-Stapel bewegen (die genaueste Methode). Achten Sie jedoch darauf, keine Zuschlagstoffe doppelt zu zählen. Um dies zu verhindern, sollten Aggregate in einer bestimmten Z-Schicht nur dann gezählt werden, wenn die Fokusebene durch die Mitte des Aggregats verläuft (Abbildung 4A).
- Berechnen Sie die FRET-Effizienz für induzierte HttQ25-YFP-Aggregate mit kolokalisiertem HttQ91-mCherry-Signal unter Verwendung der Akzeptor-Photobleichmethode.
- Erstens: Eliminieren Sie potenzielles Übersprechen zwischen YFP- und mCherry-Kanälen, indem Sie Erkennungsfenster für reine mCherry- und reine YFP-Signale einrichten, die im anderen Kanal kein Signal erzeugen. Mit diesen Einstellungen wird ein "Vorher-Bild" der einzelnen HttQ25-YFP-Punkte und des zugehörigen HttQ91-mCherry-Signals aufgenommen (Abbildung 4B).
- Dann bleichen Sie das mCherry-Signal, indem Sie den roten Laser (z. B. 552 nm) auf 100 % Intensität einstellen und scannen, bis das Signal verschwunden ist. Kehren Sie zu den Einstellungen zurück, die für das "Vorher-Bild" verwendet wurden, und erstellen Sie ein "Nachher-Bild" desselben Punktes (Abbildung 4B).
- Berechnen Sie Fluoreszenzintensitätsmessungen für jedes Punctum vor und nach dem Photobleaching mithilfe einer Bildanalysesoftware.
- Berechnen Sie die FRET-Effizienz, indem Sie die im "Vorher-Bild" (YFPinitial) gemessene YFP-Donorfluoreszenz von der YFP-Donorfluoreszenz im "Nachher-Bild" (YFPfinal) subtrahieren. Teilen Sie diesen Wert durch YFPfinal und multiplizieren Sie ihn mit 100,
Anmerkung: Die FRET-Effizienz kann pixelweise oder insgesamt für jedes HttQ25-YFP-Aggregat berechnet werden (Abbildung 4B). Das Akzeptor-Photobleaching ist eine besonders nützliche Technik zur Berechnung der FRET-Effizienz, wenn das mCherry-Signal, das mit jedem HttQ25-YFP-Punctum verbunden ist, hoch genug ist, um eine nachweisbare YFP-Dequenchierung nach dem mCherry-Photobleaching zu erzeugen.
