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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Maus für die Operation vorbereiten
- Nehmen Sie die Maus aus dem Heimkäfig und wiegen Sie (g).
- Setzen Sie die Maus in eine Isofluran-Induktionskammer und stellen Sie den Sauerstoffgehalt auf 2 l/min und den Isofluran-Verdampfer auf 5 ein, um eine chirurgische Anästhesieebene einzuleiten, etwa 3-5 Minuten. Überwachen Sie die verlangsamte Atmung und Immobilisierung. Überprüfen Sie mit dem Zehenquetschreflex, ob die Maus vollständig sediert ist.
- Wenn die Maus vollständig sediert ist, platzieren Sie sie in einem stereotaktischen Rahmen und befestigen Sie die Nase im Nasenkonus, der mit einem Schlauch mit dem Isofluran verbunden ist. Führen Sie die Ohrbügel in den Gehörgang ein und ziehen Sie sie fest, um sicherzustellen, dass der Kopf stabil ist.
- Rasieren Sie den Kopf von Ohr zu Ohr und zwischen den Augen bis hinter die Ohren.
- Sterilisieren Sie die Haut 3 Mal abwechselnd mit Tüchern aus Isopropylalkohol und Betadin-Jodlösung.
- Tragen Sie künstliche Tränen auf beide Augen auf, um zu verhindern, dass sie während des chirurgischen Eingriffs austrocknen.
>2. Chirurgischer Eingriff
- Überwachen Sie die Narkosetiefe, indem Sie den Zeh oder Schwanz einklemmen. Die Maus befindet sich in der entsprechenden Operationsebene, wenn es keine Reaktion gibt und die Atmung langsam und gleichmäßig ist.
- Machen Sie mit einer Skalpellklinge Nr. 11 einen parasagittalen Hautschnitt von knapp hinter den Augen bis fast zwischen den Ohren in einer einzigen, festen Bewegung. Schieben Sie die Haut zur Seite und schneiden Sie die rechte Seite mit dem Blutstiller ab.
- Befreien Sie den Schädel von der darüber liegenden Membran mit der stumpfen Seite des Skalpells Nr. 11 und Applikatoren mit Wattespitze. Wischen Sie den Schädel optional mit einem Applikator mit Wattespitze ab, der in 0,9%ige Kochsalzlösung getaucht ist. Vollständig trocknen lassen.
- Markieren Sie mit einem kleinen Lineal den vorderen Rand des Kraniotomies in einem Abstand von 1 mm kaudal zur Koronalnaht und den linken Rand des Kraniotomies in einem Abstand von 1 mm lateral zur sagittalen Naht (Abbildung 1) mit einem Permanentmarker. Markieren Sie dann den rechten und kaudalen Rand der Kraniotomie in einem Abstand von 4 mm von der sagittalen bzw. koronalen Naht (Abbildung 1).
- Beginnen Sie mit einem 0,5-mm-Bohrer mit einer Kraniotomie, indem Sie langsam dem Umriss des Permanentmarkers folgen. Achten Sie darauf, den Schädel nicht vollständig zu durchbrechen. Drücken Sie mit der Pinzette Nr. 5 leicht auf das isolierte Stück Scheitelknochen, Schwachstellen weichen dem Druck. Wenn der ausgedünnte Knochen am gesamten Umfang ausreichend schwach ist, kann das Knochenstück entnommen werden.
Anmerkung: Wenn der Untersucher Schwierigkeiten hat, den Knochen in einem Stück zu entfernen, deutet dies darauf hin, dass der Knochen während der Bohrung nicht ausreichend ausgedünnt wurde. Erwäge, den Schädel bei nachfolgenden Tieren weiter zu bohren, um das Entfernen des Knochenstücks zu erleichtern.
- Tragen Sie mit einer 10-ml-Spritze mit einer 23-G-Nadel eine kleine Menge 0,9%ige Kochsalzlösung auf, um den isolierten Knochen und den gebohrten Bereich zu tränken.
- Befestigen Sie den Manipulatorarm an der stereotaktischen Ausrüstung. Befestigen Sie eine neue Skalpellklinge Nr. 11 an der Sondenhalterung, wobei die scharfe Seite der Klinge rostral zeigt.
Anmerkung: Obwohl das rostrale und das kaudale Gewebe die scharfen bzw. stumpfen Kanten der Klinge erfahren, ist die mechanische Schädigung, die durch die eindringende Verletzung hervorgerufen wird, über das gesamte Ausmaß der Läsion vergleichbar. Wir beobachten keine nennenswerten Unterschiede in den Hauptmerkmalen der reaktiven Gliose, einschließlich der Hochregulierung der GFAP-Expression oder -Proliferation, zwischen rostralen und kaudalen Schnitten.
- Halten Sie den Manipulatorarm aus dem Weg und heben Sie den isolierten Knochen vorsichtig mit einer 5/45 abgewinkelten Pinzette an. Führen Sie die Spitze der Pinzette in die Seite des isolierten Knochens ein und heben Sie sie an, indem Sie das zurückgelassene Knochenstück mit einer Hebelwirkung in einer vollen Bewegung abziehen.
Anmerkung: Achte darauf, dass du nicht in das Gehirn stichst oder die Dura unter dem Schädel stört.
- Nehmen Sie ein kleines Stück des getränkten, resorbierbaren Gelschaums und legen Sie es auf das unbedeckte Gehirn, um ein Austrocknen zu verhindern und eventuell vorhandenes Blut aufzusaugen.
- Sobald der Gelschaum an Ort und Stelle ist, schwenken Sie den Manipulatorarm in Position und stellen Sie die Klinge auf die Mitte der Kraniotomie über dem Gelschaum ein. Entfernen Sie den Gelschaum und senken Sie die Klinge, bis die Spitze die Dura berührt, ohne die Dura zu durchstechen. Markieren Sie die dorsalen/ventralen Koordinaten mit der Nonius-Skala auf dem vertikalen Arm des Stereotaxiegeräts.
- Senken Sie die Klinge mit dem Arm des Manipulators langsam genau 3 mm in das Gehirn ab. Dies wird durch die Verwendung der Nonius-Skalenmarkierungen auf dem Manipulatorarm erreicht. Lassen Sie die Klinge 5-10 Sekunden lang an Ort und Stelle bleiben. Bewegen Sie den stereotaktischen Arm mit dem Klingenaufsatz dreimal von rostral nach kaudal, so dass die Klinge die rostralen und kaudalen Grenzen der Kraniotomie erreichen kann, bevor Sie sich zum gegenüberliegenden Ende bewegen.
Anmerkung: Die Dura wird vor dem Einsetzen der Klinge nicht entfernt. Im Gegensatz zur Rattendura, die ~80 μm dick ist7, ist die Maus-Dura deutlich dünner (nur wenige Zellschichten dick) und erzeugt beim Einführen keinen nennenswerten Widerstand gegen die Skalpellklinge. Verwenden Sie für jede Maus eine neue Skalpellklinge, um sicherzustellen, dass jedes Tier eine konsistente Verletzung erleidet.
- Heben Sie den stereotaktischen Arm langsam an und entfernen Sie die Klinge aus dem Gehirn. Legen Sie nach dem Entfernen der Klinge sofort ein weiteres Stück Gelschaum auf die Gehirnoberfläche, um überschüssiges Blut oder Flüssigkeit aufzusaugen.
- Entfernen Sie in der Zwischenzeit den stereotaktischen Arm und entsorgen Sie die Skalpellklinge Nr. 11. Sobald die Blutung gestoppt ist, entfernen Sie den Gelschaum.
- Verschließen Sie die Wunde, indem Sie die Haut mit nicht resorbierbaren Nähten wie Ethilon oder Prolen vernähen. Die Nähte sollten 9-10 Tage nach der Operation entfernt werden.
- Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück und lassen Sie die Maus sich langsam auf einem Heizkissen erholen und überwachen Sie sie auf Anzeichen von Stress. Die Genesung von der Isofluoran-induzierten Anästhesie erfolgt in der Regel innerhalb von 2-5 Minuten nach der Entfernung aus dem Isofluoran. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder Brustbeinlage erlangt hat.
- Verabreichen Sie 0,5-1 ml Ringer-Lösung mit Laktat subkutan, um die Flüssigkeitszufuhr sicherzustellen.
