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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Organentnahme und Bestimmung der bakteriellen Belastung
- Nach der Perfusion entnehmen Sie Organe (z. B. Leber, Milz), indem Sie vorsichtig alle Gefäße und Bänder entfernen und die Organe separat in ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen legen, das 5 ml steriles kaltes (4 °C) PBS enthält. Lagern Sie die Proben bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis.
- Um das Gehirn zu entnehmen, enthaupten Sie den Kopf hinter den Ohren mit einer Schere und schneiden Sie die Kopfhaut zwischen den Augen des Tieres entlang der Mittellinie. Schneiden Sie bei Bedarf überschüssiges Gewebe ab und halten Sie die Schere gegen den Schädel.
- Führen Sie eine Spitze der Schere vorsichtig in das Foramen magnum (das Loch in der Schädelbasis, durch das das Rückenmark verläuft) ein und schneiden Sie auf beiden Seiten seitlich in den Schädel.
- Schneide den Schädel vorsichtig zwischen den Augen des Nagetiers entlang der Mittellinie und übe dabei seitlichen Druck aus. Vermeiden Sie es, das Gehirn zu stören und halten Sie den Kontakt zwischen dem Hirngewebe und der Schere so gering wie möglich.
- Öffnen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze den Schädel, um das Gehirn freizulegen, und platzieren Sie einen Spatel zwischen der Unterseite des Gehirns und der Schädelbasis, um das Gehirn zu entfernen.
Anmerkung: Dies führt zum Reißen von Nervenfasern des Gehirns.
- Übertragen Sie das Gehirn vorsichtig in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das 5 ml steriles kaltes PBS enthält.
- Entsorgen Sie den Mäusekadaver und wiederholen Sie diese Schritte für die restlichen Tiere.
Anmerkung: Sobald alle Organe entnommen wurden, reinigen Sie den Eingriffsbereich und bereiten Sie die Organhomogenisierung vor, um die bakterielle Belastung zu bestimmen.
- Reinigen und sterilisieren Sie die Spitze eines Gewebehomogenisators, der in einer Biosicherheitswerkbank aufbewahrt wird, indem Sie die Spitze einführen und den Homogenisator 10 s lang nacheinander in 5 % Bleichmittel, sterilem Wasser, 75 % Ethanol und sterilem Wasser laufen lassen, die jeweils in einem separaten konischen 15-ml-Röhrchen enthalten sind.
- Homogenisieren Sie das infizierte Gehirn (~20 s auf Stufe 6, maximale Drehzahl) im konischen 15-ml-Röhrchen, bis keine sichtbaren Gewebefragmente mehr übrig sind.
- Reinigen Sie den Homogenisator wie in Schritt 1.3 beschrieben, um eine bakterielle Verschleppung auf die nächste Organprobe zu verhindern.
- Führen Sie den Homogenisierungsprozess für alle anderen Organe (z. B. Leber, Milz) durch.
- Sobald der Homogenisierungsprozess abgeschlossen ist, reinigen Sie den Homogenisator wie in Schritt 1.3 beschrieben und lagern Sie ihn bis zur weiteren Verwendung.
- Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen der Organhomogenate in sterilem PBS vor und plattieren Sie die Verdünnungen auf BHI-Agar/Streptomycin-Platten, um die KBE pro Organ zu bestimmen.
HINWEIS: Eine ähnliche Methode wird durchgeführt, um die KBE pro ml Blut zu bestimmen.
- Nachdem alle Verdünnungen plattiert sind, stellen Sie die Platten über Nacht in einen 37 °C-Inkubator um.
- Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte, um die Gesamtzahl der Bakterien pro Organ oder ml Blut wie folgt zu bestimmen:
KBE/Organ = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / ml Homogenat plattiert x 5
KBE/ml Blut = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / ml plattiertes Blut