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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Immunfluoreszenz-Protokoll
- Dissektion von Gewebe
- Opfern Sie den Zebrafisch durch Eintauchen in Eiswasser (5 Teile Eis/1 Teil Wasser, 4 °C); lassen Sie ihn bis zur Einstellung jeglicher Bewegung stehen, um den Tod durch Hypoxie zu gewährleisten.
- Entfernen Sie den Kopf mit einer Rasierklinge. Entfernen Sie mit einer Pinzette weiches Gewebe von der ventralen Seite des Schädels. Öffnen Sie den Schädel und entfernen Sie den Knochen von der ventralen Seite des Gehirns. Entferne die Haut und die Schädelknochen von der dorsalen Seite des Gehirns. Entferne das Gehirn.
- Fixierung des Gewebes
- Fixieren Sie das Gehirn durch Eintauchen für 3 h in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C.
- Bereiten Sie 0,1 M Phosphatpuffer (PB) vor, indem Sie 1,755 g NaH2PO4H2O und 4,575 g Na2HPO4 in 450 mL destilliertem Wasser (dH2O) auflösen und mit der erforderlichen Menge NaOH 1N auf einen pH-Wert von 7,4 einstellen.
- Bereiten Sie 4 % PFA vor, indem Sie 4 g PFA in 100 ml 0,1 M PB (pH 7,4) durch Rühren auf einer Heizplatte lösen. Wenn eine Temperatur von 60 °C erreicht ist, fügen Sie 2-4 Tropfen NaOH 1N hinzu, um eine klare Lösung zu erhalten. Lassen Sie PFA 4% bei Raumtemperatur (RT) und kontrollieren Sie den pH-Wert. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.4.
ein.
Anmerkung: Der Zeitpunkt der Fixierung hängt von der Gewebegröße ab. Eine Gewebefixierung von mehr als 4–6 h kann zu einer Überfixierung führen, die Antigene maskiert und die Antikörper-Epitop-Bindung einschränkt.
- Einbettung von Gewebe
- Spülen Sie die Tücher 3x für jeweils 5 min mit 0,1 M PB (pH 7,4) aus.
- Für die Kryoprotektion das Gewebe auf 20% Saccharose in PB (0,1 M, pH 7,4) übertragen und über Nacht bei 4 °C aufbewahren. Dann das Gewebe auf 30 % Saccharose in 0,1 M PB (pH 7,4) übertragen und eine weitere Nacht bei 4 °C aufbewahren.
- Betten Sie das Gewebe in einen Block mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein. Bereiten Sie dazu einen kleinen Dewar aus flüssigem Stickstoff vor, nehmen Sie Alufolie und schneiden Sie sie in zwei Hälften, um eine Pfanne zu erhalten. Die Schale mit den mit der OCT-Verbindung gefüllten Geweben muss in den flüssigen Stickstoff getaucht werden, bis die OCT-Verbindung abgekühlt ist. Das gefrorene Gewebe kann bis zum Schnitt bei -80 °C gelagert werden.
- Schneiden von Gewebe
- Die gefrorenen Gewebeblöcke werden bei -20 °C in einen Kryostaten überführt und in koronale oder sagittale Schnitte von 10 μm geschnitten.
- Das Gewebe wird in abwechselnden seriellen Schnitten auf immunhistochemisch geeignete Klebeglasobjektträger aufgebracht und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.
Anmerkung: Bewahren Sie Dias zwischen -20 °C und 4 °C in einer dunklen Diabox oder einem Diabuch auf.
- Blockierung unspezifischer Bindungsstellen und Gewebepermeabilisierung
- Markieren Sie den Gewebebereich auf dem Objektträger mit einem lösungsmittelbeständigen Stift.
- Spülen Sie die Sektionen 3x für jeweils 5 min mit 0,1 M PB (pH 7,4).
- Inkubieren Sie die Schnitte mit 1% normalem Eselsserum, gelöst im Permeabilisierungspuffer PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) für 30 min bei RT, um die Zellmembran zu permeabilisieren und die unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren.
- Bereiten Sie Triton X-100 0,3 % vor, indem Sie 0,3 mL Triton X-100 in 100 mL mit 0,1 M PB (pH 7,4) auflösen.
- Bereiten Sie die Blockierungslösung vor, indem Sie 1% normales Eselsserum in PB auflösen, das 0,3% TritonX-100.
Anmerkung: Die Tierspezies des Serums, das in den Permeabilisierungs- und Blockierungspuffern verwendet wird, hängt vom Wirt des Sekundärantikörpers ab.
- Inkubation mit einer Mischung aus Primärantikörpern
- Spülen Sie die Sektionen 3x für jeweils 5 min mit 0,1 M PB (pH 7,4).
- Inkubieren Sie die Schnitte über Nacht in einer feuchten Box bei RT mit einer Mischung aus in PB-T verdünnten Primärantikörpern. Die folgenden Mischungen von Primärantikörpern können verwendet werden: Ziegen-Antikörper gegen Orexin-Rezeptor (OX-2R) verdünnt 1:100/Kaninchen-Antikörper gegen Cannabinoid-Rezeptor (CB1R) verdünnt 1:100 oder Ziegen-Antikörper gegen Orexin-Peptid (OX-A) verdünnt 1:100/Kaninchen-Antikörper gegen CB1R verdünnt 1:100.
- Inkubation mit Mischung aus Sekundärantikörpern
- Spülen Sie die Sektionen 3x für jeweils 5 min mit 0,1 M PB (pH 7,4).
- Inkubieren Sie die Schnitte 2 Stunden lang bei RT mit 1) einer Mischung aus Esel-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488-konjugiertem Sekundärantikörper und Esel-Anti-Ziegen-Alexa Fluor 594-konjugiertem Sekundärantikörper, verdünnt 1:100 in PB-T; oder 2) eine Mischung aus Esel-Anti-Ziegen-Alexa-Fluor-488-konjugiertem Sekundärantikörper und Esel-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor-594-konjugiertem Sekundärantikörper, verdünnt 1:100 in PB-T.
Anmerkung: Verwenden Sie Sekundärantikörper, die im selben tierischen Wirt entwickelt wurden. Das normale Serum muss zur gleichen Spezies von Sekundärantikörpern gehören (z. B. verwenden Sie Sekundärantikörper, die in einem Esel entwickelt wurden, und ein normales Eselserum). Verdünnen Sie die primären und sekundären Antikörper mit einem Blockierungspuffer, der das Detergens enthält, um die Zellpermeabilisierung zu erhöhen und den Hintergrund zu reduzieren.
- Befestigung von Gewebe
- Spülen Sie die Sektionen 3x für jeweils 5 min mit 0,1 M PB (pH 7,4).
- Die Schnitte werden mit dem Kernfarbstoff DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) gegengefärbt, der 1,5 μl DAPI (1 mg/ml) in 3 ml PB auflöst.
- Deckglas-Dias mit Montagemedium (siehe Materialtabelle). Dieses wässrige Eindeckmedium stabilisiert die Gewebeprobe und färbt sie für den Langzeitgebrauch. Fluoreszierende Proben können im Dunkeln bei 4 °C gelagert werden. Um die Lebensdauer von Fluorophoren zu verlängern, verwenden Sie ein Antifading-Eindeckmedium.
Anmerkung: Wählen Sie ein gutes Eindeckmedium. Einer der wichtigsten Parameter von Eindeckmitteln ist der Brechungsindex (nD), der bei etwa 1,5, dem Brechungsindex von Glas, liegen sollte. Das hier verwendete Einbettmedium kann insbesondere bei Proben verwendet werden, die für Enzym- und Lipidbestimmungen vorbereitet sind (d. h. Proben, die nicht mit einer aufsteigenden Reihe von Alkohol dehydriert werden dürfen).
- Steuerung
- Die Abschnitte 1.1–1.8 sind zu wiederholen, wobei der primäre oder sekundäre Antikörper weggelassen wird oder im spezifischen Schritt die primären oder sekundären Antiseren durch PB (Negativkontrolle) ersetzt werden.
- Wiederholen Sie die Abschnitte 1.1–1.8 und resorbieren Sie jeden Primärantikörper mit einem Überschuss des relativen Peptids (100 mg Peptid/1 ml verdünntes Antiserum).
- Die Abschnitte 1.1–1.8 werden an Schnitten des Gehirns von Mäusen (Positivkontrolle) wiederholt.
Anmerkung: Bereiten Sie alle Puffer frisch vor, kurz vor dem Start. Entfernen Sie den Flüssigkeitsüberschuss bei jedem Schritt vorsichtig mit einer Pipette oder einem Filterpapier um die Schnittstellen herum und halten Sie den Schnitt immer feucht.