>1. Etablierung des BBB-Modells
Hinweis: Für die Etablierung des Blut-Hirn-Schranken-Modells (BHS) empfehlen wir, kommerziell erhältliche primäre mikrovaskuläre Endothelzellen (RBMECs) des Rattenhirns und kortikale Astrozyten (RCAs) der Ratte zu verwenden. Alle Schritte müssen mit sterilen Reagenzien und Einwegartikeln durchgeführt werden, die in einer Laminar-Flow-Haube gehandhabt werden.
- Zellkultur
- Beschichten Sie Zellkulturflaschen mit Poly-L-Lysin 100 μg/ml (1 Std. bei Raumtemperatur, RT) oder Fibronektin 50 μg/ml (1 Std. bei 37 °C), um die Bindung von RCAs bzw. RBMECs zu fördern. Tauen Sie dann 1 x 106 RCAs und 5 x 105 RBMECs in Endothelzellmedium auf, ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum, 1 % Endothelzellwachstumsergänzung und 1 % Penicillin/Streptomycin (sECM). Seed RCAs in einem T175-Kolben in 20 ml sECM und RBMECs in einem T75-Kolben in 10 ml sECM.
Hinweis: Die Auftau- und Aussaatpassagen von RCAs und RBMECs müssen in Bezug auf die Zelldichte und die Zeit in Kultur entsprechend der Anzahl der Versuchsbedingungen angepasst werden, die mit dem BHS-Modell getestet werden sollen. Wenn man mit 1 Fläschchen mit 1 x 106 RCAs und 1 Fläschchen mit 5 x 105 RBMECs beginnt, ist es möglich, bis zu 20 BHS-gelagerte Einsätze zu erhalten.
- Halten Sie die Zellen ca. 6 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre, bis etwa 80 % Konfluenz für RCAs und über 90 % Konfluenz für RBMECs erreicht sind. Die Zellen werden 5 Minuten lang mit Trypsin-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (Trypsin-EDTA)-Lösung (Trypsin 1:250) abgetrennt (1 ml Trypsin für T75-Kolben und 2 ml für T175-Kolben). Stoppen Sie die Trypsinaktivität mit sECM (2:1), zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen 5 Minuten lang bei 750 × g und resuspendieren Sie die Pellets in 60 ml sECM.
- Teilen Sie die RBMECs in 3 T175-Kolben auf und kultivieren Sie sie weitere 3 Tage in sECM, bevor Sie sie auf Einsätze aussäen. Zählen Sie die Gesamtzahl der lebenden RCAs, indem Sie eine im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau verdünnte Zellsuspension unter einem optischen Mikroskop in einer Burker-Kammer beobachten.
- Cell Seeding auf Einfügungen
- Behandeln Sie eine Seite der Polyethylenterephthalat (PET)-Membran von 6 transparenten Multiwell-Einsätzen mit Poly-L-Lysin 100 μg/ml und die andere Seite mit Fibronektin 50 μg/ml, um die Anheftung von RCAs und BMECs zu ermöglichen. Fassen Sie die Einsätze mit einer Pinzette an, um den Kontakt mit der PET-Membran zu vermeiden.
- Legen Sie die Einsätze in eine 6-Well-Platte und geben Sie Fibronektinlösung (mindestens 500 μl) in die obere Kammer. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 °C entfernen Sie die Fibronektinlösung, nehmen die Einsätze von der Multi-Well-Platte und legen sie kopfüber auf den Boden einer 150 cm2 Petrischale, die hier als sterile Stütze für die bereits beschichteten Einsätze verwendet wird.
- Geben Sie vorsichtig 800 μl Poly-L-Lysin auf die Unterseite des Einsatzes (wie in Abbildung 1A gezeigt; als RCA-Seeding bezeichnet) und halten Sie die Lösung 1 Stunde lang bei RT auf den Einsatzeinsätzen.
- Aspirieren Sie die Lösung und lassen Sie die Einsätze 15-30 min bei RT trocknen. Die Einsätze sind nun bereit für die Zellaussaat, können aber auch mehrere Tage in der Multiwell-Platte bei 4 °C gelagert werden, bevor mit dem BHS-Aufbau fortgefahren wird.
Hinweis: Denken Sie daran, mindestens 3 beschichtete Einsätze frei von Zellen zu halten, die als Kontrollen zur Validierung der BHS-Etablierung durch FD40-Flussmittelmessungen verwendet werden können.
- Aussaat von RCAs (35.000/cm2) auf die Unterseite der Poly-L-Lysin-beschichteten Inserts, indem 800 μl Zellsuspension auf den umgedrehten Insert getropft werden (Abbildung 1A). Lassen Sie die RCA-Suspension 4 Stunden lang bei RT auf den Einsätzen, um eine effiziente Befestigung der Zellen an der Membran zu ermöglichen.
- Aspirieren Sie die Restlösung, legen Sie die Einsätze in Vertiefungen mit 2 ml sECM und halten Sie die Multiwell-Platte bei 37 °C und 5 % CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre, wobei die sECM alle 2 Tage gewechselt wird.
- Nach 3 Tagen, wenn die RCAs die Unterseite des Einsatzes beschichtet haben, säen Sie RBMECs auf der Oberseite des Einsatzes aus, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
- Die RBMEC werden von den T175-Kolben abgenommen und die Gesamtzahl der lebenden Zellen gezählt, wie in den Schritten 1.1.2 und 1.1.3 beschrieben.
- Seed-RBMECs (60.000/cm 2) auf die Oberseite des Einsatzes in sECM (1.000 μl) (Abbildung 1B), wobei 3 Einsätze nur mit den Astrozyten verbleiben, um sie als Hintergrund für den transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER) zu verwenden. Platzieren Sie die Multi-Well-Platte unter Standardkulturbedingungen. Halten Sie das System mindestens 3 Tage lang in Kulturzustand und wechseln Sie das sECM in der inneren und unteren Kammer alle 2 Tage.
>2. BBB-Validierung
- TEER-Messung
- Überprüfen Sie am 3. Tag der Co-Kultur den TEER, indem Sie die BHS-Lagereinsätze in eine geeignete Kammer (mit einer Kappe und in der sowohl die Kammer als auch die Kappe ein Paar Spannungs- und Stromelektroden enthalten) einführen, die mit 4 ml sECM gefüllt ist. Anschluss an ein Volt/Ohmmeter aus Epithelgewebe.
- Notieren Sie zusammen mit den TEER-Messungen der Zellen-BBB-Systeme die TEER-Werte der 3 Einsätze mit den RCAs, die von den mit den BHS erhaltenen Werten abgezogen werden. Multiplizieren Sie die resultierenden TEER-Werte mit der Oberfläche des Einsatzes (4,2 cm2), um die Ergebnisse als Ω xcm 2 auszudrücken.
- Ab dem 3. Tag der Co-Kultur messen Sie den TEER jeden Tag. Anmerkung: Nach einer anfänglichen Phase, in der der TEER ansteigt, sollten die aufgezeichneten Werte für mindestens zwei aufeinanderfolgende Tage stabil bleiben (in der Regel zwischen dem 5. und dem 7. Tag der Co-Kultur). Zu diesem Zeitpunkt ist die BHS bereit für den zweiten Schritt der Validierung (Abschnitt 2.2) und/oder für die trans-BHS-Experimente.
Hinweis: Das in Abschnitt 2.1 beschriebene Verfahren kann auf denselben BHS-Systemen durchgeführt werden, die für die folgenden Permeabilitätsexperimente (Abschnitt 3) verwendet wurden. Unter sterilen Bedingungen arbeiten.
>3. Trans-BHB-Permeation von FITC-geladenen Ferritinen (FnN)
Hinweis: Eine rekombinante Variante von humanem Ferritin (Fn), die in Escherichia coli produziert und in Nanokäfigen (FnN) zusammengebaut wird. FnN sind mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) beladen, und die Konzentrationen sowohl von Fn als auch von den geladenen Molekülen werden genau bestimmt.
- Trans-BHS-Fluss von FITC und FITC-FnN
- Messen Sie den FITC-FnN-Fluss von der oberen zur unteren Kammer validierter BHS-Modelle (in der Regel am 5. - 7. Tag der Co-Kultur) im Vergleich zu dem des freien Farbstoffs nach 7 und 24 Stunden Inkubation nach den folgenden Schritten:
- FITC-FnN (50 μg/ml FnN, 1,1 μM FITC) oder eine gleiche Menge freies FITC in die obere Kammer von mindestens 6 BHS-Systemen für jede Formulierung geben, um 2 ml sECM-Lösung aus der unteren Kammer von mindestens 3 Inserts nach 7 Stunden und aus der unteren Kammer von 3 Inserts nach 24 Stunden zu entnehmen.
- Die Fluoreszenzintensität von 500 μl der gesammelten Proben wird mit einem Spektrofluorometer (λex 488 nm, λem 515 nm, Spalt 5) gemessen.
- Ermitteln Sie die sECM-Hintergrundfluoreszenz durch Messung von 500 μl Medium unter Verwendung derselben Analyseparameter. Subtrahieren Sie die sECM-Hintergrundfluoreszenz von allen FITC- oder FITC-FnN-Fluoreszenzwerten.
- Bestimmen Sie die Konzentration von permeatisiertem FITC oder FITC-FnN durch Vergleich der erhaltenen Fluoreszenzwerte mit zwei verschiedenen Kalibrierkurven, die mit bekannten Konzentrationen (d. h. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) des in 500 μl sECM gelösten freien oder nanoformulierten Farbstoffs erstellt wurden.
