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>1. Proteasom-Aktivitäts-Assay
HINWEIS: Die Proteasomaktivität kann in homogenisiertem Hirngewebe mit einer leicht modifizierten Version des 20S Proteasome Activity Kit gemessen werden. Dieser Assay misst nicht direkt die Aktivität vollständiger 26S-Proteasomkomplexe. Vielmehr misst es die Aktivität des 20S-Kerns, was bedeutet, dass es nur als Proxy dienen kann, um die Aktivität des Kerns selbst im Gegensatz zum gesamten 26S-Proteasom-Komplex zu verstehen. Der Erfolg dieses Assays nimmt mit wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen und/oder zunehmendem Gehalt an Reinigungsmitteln, insbesondere ionischen, ab und erfordert die Verwendung eines Plattenlesegeräts mit einem 360/460 (Anregungs-/Emissions) Filtersatz und Heizmöglichkeiten bis zu 37 °C.
- Einstellungen des Plattenlesers: Auf 37 °C vorwärmen und während des Laufs halten.
- Stellen Sie die Anregung auf 360 und die Emission auf 460 ein. Wenn die verwendete 96-Well-Platte klar ist, stellen Sie die Position der Optik auf Unten. Wenn eine dunkle/schwarze 96-Well-Platte verwendet wird, stellen Sie die Optikposition auf Oben.
- Stellen Sie ältere Plattenlesermodelle unter den Optionen für den Fluoreszenzleser auf Auto-Gain ein, neuere Modelle sind dafür voreingestellt. Programmieren Sie einen kinetischen Lauf mit einer Zeit von 2 Stunden, bei dem alle 30 Minuten gescannt (gelesen) wird.
- Rekonstituieren Sie den im Kit enthaltenen 10x Assay-Puffer mit 13,5 ml Reinstwasser. Fügen Sie 14 μL 100 mM ATP zum nun 1x Puffer hinzu; Dies erhöht die Proteasomaktivität in den Proben erheblich und verbessert die Zuverlässigkeit des Assays. Der endgültige 20S Assay-Puffer kann bis zur Verwendung auf Eis oder bei 4 °C gelagert werden und ist mehrere Monate lang stabil.
- Rekonstituieren Sie den AMC-Standard, der im Kit enthalten ist, mit 100 μl DMSO. Führen Sie diesen Schritt im Dunkeln oder bei schlechten Lichtverhältnissen durch, da der Standard lichtempfindlich ist.
- Erstellen Sie eine Standard-AMC-Kurve mit dem rekonstituierten Standard, im Dunkeln oder bei schlechten Lichtverhältnissen.
- In separaten 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 und 0 μl des AMC-Standards zugegeben, was einer AMC-Konzentration von 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0 μM entspricht.
- Zu diesen Röhrchen werden in der gleichen Reihenfolge 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 und 100 μl 20S Assay-Puffer hinzugefügt. Dadurch entsteht eine Reihe von hohen bis niedrigen AMC-Konzentrationen, die für die Kalibrierung von Platten-Readern und die Analyse der Proteasomaktivität in den homogenisierten Proben verwendet werden.
- Lagern Sie alle verdünnten Standards bis zur Verwendung auf Eis im Dunkeln.
- Rekonstituieren Sie das Proteasomsubstrat (Suc-LLVY-AMC), das im Kit mit 65 μl DMSO geliefert wird. Führen Sie diesen Schritt im Dunkeln oder bei schlechten Lichtverhältnissen durch, da das Substrat lichtempfindlich ist. Erstellen Sie eine Verdünnung des Proteasomsubstrats im Verhältnis 1:20 in einem neuen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung des 20S Assay-Puffers. Lagern Sie das verdünnte Substrat bis zur Verwendung auf Eis im Dunkeln.
Anmerkung: Wenn die Platte beispielsweise 10 Proben und 1 Blindprobe enthält, benötigen Sie genügend verdünntes Substrat für 22 Vertiefungen (mit Duplikaten) mit 10 μl pro Vertiefung. Dies entspricht einem Bedarf von 220 μl + 30 μl für Pipettierfehler, wobei 12,5 μl Substrat und 237,5 μl 20S Assay-Puffer erforderlich sind.
- Tauen Sie die gewünschten Proben auf (falls eingefroren) und geben Sie eine normalisierte Menge auf eine 96-Well-Platte. Führen Sie jede Stichprobe in Duplikaten aus. Die benötigte Probenmenge variiert je nach Gewebevorbereitung. Im Allgemeinen sind 10-20 μg für jede subzelluläre Fraktion ausreichend.
- Bringen Sie das Volumen der Probenvertiefung mit Reinstwasser auf 80 μl. Die zugegebene Menge hängt von der Menge der zugegebenen Probe ab. Wenn beispielsweise Probe 1 4,5 μl Protein und Probe 2 8,7 μl enthielt, beträgt die benötigte Wassermenge 75,5 μl bzw. 71,3 μl. In zwei getrennten Vertiefungen nur 80 μl Wasser hinzufügen; Dabei handelt es sich um die Untersuchungsleerproben.
Anmerkung: Um Änderungen des Proteinvolumens aufgrund von Pipettierfehlern zu begrenzen, können die Proteinkonzentrationen auf die am wenigsten konzentrierte Probe normalisiert werden. Dies ermöglicht die Verwendung des gleichen Probenvolumens unter allen Bedingungen.
- Geben Sie 10 μl 20S Assay-Puffer in jede Vertiefung, einschließlich der Assay-Rohlinge. Hier wird eine Repeater-/automatisierte Pipette empfohlen, um ein konsistentes Assay-Volumen über alle Wells hinweg zu gewährleisten.
- Optional: Führen Sie in dieser Phase auf Wunsch In-vitro-Manipulationen ein. Dies erfordert, dass jede Probe zusätzlich 2 Wells pro Behandlung hat, einschließlich des Vehikels. Wenn ja, fügen Sie 5-10 μl des Arzneimittels/der interessierenden Verbindung in 2 der Probenvertiefungen und ein entsprechendes Volumen der Kontrolle/des Vehikels in weitere 2 Vertiefungen hinzu. Legen Sie die Platte für 30 Minuten auf den vorgewärmten Plattenleser oder in einen 37 °C heißen Inkubator.
- Schalten Sie das Licht aus oder begeben Sie sich in einen dunklen Raum. Geben Sie alle 100 μl verdünnter AMC-Standards in eine neue Vertiefung; Jeder Standard verfügt über ein einzelnes Bohrloch.
- Geben Sie im Dunkeln 10 μl verdünntes Proteasomsubstrat in Vertiefungen, die Proben- und Assay-Rohlinge enthalten, jedoch nicht nach dem AMC-Standard. Hier wird eine Repeater-/automatisierte Pipette empfohlen, um ein konsistentes Assay-Volumen über alle Wells hinweg zu gewährleisten.
- Legen Sie die Platte in den Plattenleser und starten Sie den kinetischen Lauf.
Anmerkung: Die Platte muss während des kinetischen Laufs nicht ständig geschüttelt werden, der Benutzer kann dies jedoch auf Wunsch tun
- Exportieren Sie am Ende des kinetischen Laufs rohe 360/460-Fluoreszenzwerte nach Microsoft Excel.
- Bilden Sie den Durchschnitt der doppelten Wells für jeden Standard, jede Probe und den Assay-Rohling für alle 5 Scans. Die Rohfluoreszenzwerte sollten über die Scans der Proben ansteigen, aber für Standards und Assay-Leerproben stabil bleiben (oder leicht abnehmen).
- Nehmen Sie den höchsten AMC-Standard, den Well-Durchschnitt und dividieren Sie durch die bekannte Konzentration (20 μM). Teilen Sie diesen Wert durch die im Assay verwendete Probenkonzentration, um einen standardisierten AMC-Wert zu erhalten. Dividieren Sie für jede Probe und jeden Assay-Blindwert durch den standardisierten AMC-Wert.
- Nehmen Sie diesen Endwert und dividieren Sie ihn durch die Probenkonzentration, die im Assay verwendet wurde, um den normalisierten Wert für jede Probe und den Assay-Blindwert zu erhalten. Tun Sie dies für alle 5 Scans.
- Subtrahieren Sie den normalisierten Assay-Leerwert von jedem normalisierten Probenwert für alle 5 Scans.