Methodenartikel

Gewinnung von Zellsuspensionen aus ischämischem Gewebe des Gehirns von Mäusen

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Pösel, C., et al. Isolierung und durchflusszytometrische Analyse von Immunzellen aus dem ischämischen Mausgehirn. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Isolierung von Gehirnzellen und infiltrierten Immunzellen aus ischämischem Gehirngewebe von Mäusen durch enzymatische Verdauung, gefolgt von der Entfernung von Zelltrümmern und Myelin durch Dichtegradientenzentrifugation, um Entzündungsreaktionen in der Schlaganfallforschung zu untersuchen.

Protokoll

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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der entsprechenden tierethischen Überprüfung überprüft und genehmigt.

>1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Verdauungspuffer (1 ml pro Hemisphäre): Lösen Sie eine standardisierte Mischung aus gereinigten Verdauungsenzymen, z. B. Liberase mit niedriger Thermolysinkonzentration (TL) auf eine Konzentration von 2 U/ml in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), die Calcium (Ca) und Magnesium (Mg) enthält.
  2. Waschpuffer mit DNAse: DNAse I bis zu einer Konzentration von 666U/ml in HBSS (Ca/Mg (Calcium/Magnesium) frei) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) auflösen.
  3. Waschpuffer ohne DNAse: HBSS (Ca/Mg-frei) mit 10% FCS.
  4. Dichtegradientenmedium (5 ml pro Hemisphäre): Bereiten Sie isotonisches Dichtegradientenmedium (SIP; 100%) zu, indem neun Teile Dichtegradientenmedium mit einem Teil 1,5 M Natriumchlorid gemischt werden. SIP auf 25 % Dichte verdünnen, indem ein geeignetes Volumen HBSS (Ca/Mg-frei) mit 3 % FCS zugegeben wird.

>2. Dissoziation von Hirngewebe in Einzelzellsuspensionen

  1. Hirnstamm und Kleinhirn vorsichtig mit einer sauberen Rasierklinge entfernen. Verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um das Gehirn zu hemisezieren, und schneiden Sie jede Hemisphäre entlang der koronalen Ebene in drei etwa gleich große Stücke.
  2. Zerkleinern Sie das präparierte Gewebe jeder Hemisphäre durch ein 100-μm-Zellsieb mit dem Kolbenende einer 5-ml-Spritze. Spülen Sie das Zellsieb kontinuierlich mit eiskaltem HBSS (+Ca/Mg) aus. Lagern Sie homogenisierte Proben auf Eis.
    3. Bei
  3. 286 x g und 4° C 5 min zentrifugieren, den Überstand vorsichtig entsorgen. Das Pellet wird in 1 ml Aufschlusspuffer resuspendiert und die Suspension in ein 2-ml-Röhrchen überführt. Die Suspension 1 Stunde lang unter langsamer, kontinuierlicher Rotation bei 37 °C inkubieren.
  4. Die Zellsuspension wird durch ein 70 μm Zellsieb gesiebt und gründlich mit 3 ml Waschpuffer mit DNAse und anschließend mit 15 ml DNAse-freiem Waschpuffer gespült. Bei 286 x g und 18 °C 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Anmerkung: Die Verwendung von DNAse eliminiert DNA-Schleim, der durch die Zelllyse verursacht wird, was zu einer Zellaggregation führen und das Überleben der Zellen beeinträchtigen kann.

>3. Dichtegradientenzentrifugation zur Entfernung von Myelin und Zelltrümmern

  1. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml Gradientenmedium mit 25 % Dichte und pipettieren Sie die Suspension in ein 15-ml-Röhrchen. Gründlich mischen durch wiederholtes und sanftes Pipettieren, um Blasenbildung zu vermeiden. Anmerkung: Bei der RT sollte Dichtegradientenmedium verwendet werden, um eine Verklumpung der Zellen zu verhindern.
  2. Zentrifugieren Sie bei 521 x g und 18 °C für 20 min. Verwenden Sie das niedrigste Beschleunigungsprofil des Rotors und lassen Sie den Rotor ohne Bremse stoppen. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig und ohne Schütteln aus der Zentrifuge. Aspirieren Sie vorsichtig die Myelinhülle und den Überstand, während Sie das Zellpellet am Boden des Röhrchens aufbewahren. Anmerkung: Achten Sie darauf, die gesamte Myelinhülle zu entfernen, da Reste die durchflusszytometrische Analyse beeinträchtigen können.
  3. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml DNAse-freiem Waschpuffer und pipettieren Sie die Suspension in ein neues 15-ml-Röhrchen. Anmerkung: Dieser Waschschritt ist von entscheidender Bedeutung, da eine ausreichende Entfernung des Dichtegradientenmediums erheblich zur Quantität und Qualität der endgültigen Zellprobe beiträgt.
  4. Bei 286 x g und 10 °C erneut 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl Kaltwaschpuffer und bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss in einem Hämozytometer. Lagern Sie die Proben bei 4 °C und verarbeiten Sie sie schnell weiter.

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MACSmix RöhrenrotatorMiltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+Thermo Scientific
Hanks gepufferte Salzlösung (HBSS)Gibco/Life Technologies GmbHNr. 14175-129
HBSS mit Calcium/MagnesiumGibco/Life Technologies GmbHArtikel-Nr.: 24020-091
Liberase TLRoche Diagnostics GmbH5401020001Bei Raumtemperatur verwenden
Percoll PlusGE Healthcare Europe GmbHTel.: 17-5445-01
Fötales RinderserumPAN Biotech3302-P101003
Trypan-BlauGibco/Life Technologies GmbHTel.: 15250-061
TrucountBD Biowissenschaften340334
Phosphatgepufferte KochsalzlösungBiochrom AGL 182-10
DNase IRoche Diagnostics GmbH11284932001
Silikonschlauch, 1mWeltpräzisionsinstrumente503022
Feine Irisschere scharf/stumpfWerkzeuge für die FeinwissenschaftNr. 14028-10
Gerade Pinzette mit 1x2 ZähnenWerkzeuge für die FeinwissenschaftNr. 11021-14
Zange mit stumpfem EndeWerkzeuge für die FeinwissenschaftNr. 11008-13
5 ml SpritzenkolbenCarl Roth GmbH (Braun)EP96.1
Zellsieb, 100μmDr. I. Schubert, BDArtikel-Nr.: 2360-00
Omnican Feindosierspritze 1MLBraunTbd
Zell-Sieb, 70μmGreiner Bio-One GmbHTel.: 542 070
serologische Pipetten, 10mlGreiner Bio-One GmbHArtikel-Nr.: 607180
serologische Pipetten, 10mlSarstedt AG&Co86,12,54,025
Serologische Pipetten, 25mlGreiner Bio-One GmbHArtikel-Nr.: 760180
serologische Pipetten, 5mlGreiner Bio-One GmbHArtikel-Nr.: 606180
serologische Pipetten, 25mlSarstedt AG&Co86,16,85,020
serologische Pipetten, 5mlSarstedt AG&Co86,12,53,025
Spitzen, 0,1-10μlCorning B.V.Life WissenschaftenNr. 4840
Spitzen, 100-1000μlGreiner Bio-One GmbHArtikel-Nr.: 740290
Spitzen, 10-200μlGreiner Bio-One GmbH739296
Reaktionsgefäße 1,5mlGreiner Bio-One GmbH616201
Reaktionsgefäße 2mlGreiner Bio-One GmbH623201
Bakteriologische Petrischale, 94x16mmGreiner Bio-One GmbHArtikel-Nr.: 633180
Falke 15mlGreiner Bio-One GmbH188271
Falke 50mlVWR International GmbH (BD)Tel.: 734-0448
Neubauer HämozytometerBiochrom AGPDHC-N01
RasierklingeCarl Roth GmbHCK07.1
kg kg kg

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