Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Vorbereitung von Reagenzien und Vorräten
- Bestimmen Sie die Dosis, die Einstufungshäufigkeit und den experimentellen Zeitplan, die für die Prüffrage geeignet sind (Abbildung 1)< L-3,4-Dihydroxyphenylaninmethylester-Hydrochlorid (Levodopa oder L-DOPA) und Benserazidhydrochlorid, einen peripheren Decarboxylase-Inhibitor (siehe Materialtabelle).br />
Anmerkung: Prüffragen können gestellt werden, um eine beliebige Anzahl von Antworten zu erhalten, die von der Frage, ob eine spezifische Therapie bestehende L-DOPA-induzierte Dyskinesien (LID) reduzieren könnte, bis hin zur Verhinderung der LID-Induktion reichen. Sie können auch untersuchen, ob die therapeutische Wirksamkeit von der Dosis von Levodopa abhängt oder ob die LID-Expression und/oder die therapeutische Wirksamkeit je nach Geschlecht, Spezies und Alter des Probanden variiert.
- Wiegen Sie Ratten wöchentlich, um die geeignete Arzneimittelmenge auf der Grundlage der laufenden Gewichtsveränderungen während der Studie zu berechnen.
Anmerkung: Aufgrund der erhöhten Aktivität bei LID+-Ratten besteht das Potenzial für Gewichtsverlust mit Langzeitbehandlungen mit L-DOPA. Wenn ein Gewichtsverlust auftritt, versorgen Sie Ratten nach L-DOPA-Injektionen mit ernährungsphysiologisch vollständigen, sehr schmackhaften Leckereien (siehe Materialtabelle).
- Berechnen Sie die Menge an L-DOPA und Benserazid, die für jede wöchentliche Konzentration erforderlich ist, wiegen Sie lyophilisierte Aliquots für jeden Tag der Injektion ab und lagern Sie sie in Kombination für 1–2 Wochen bei -20 °C in braunen Glasfläschchen bis zum Tag der Behandlung.
Anmerkung: Die Zieldosis beträgt 12 mg/kg oder 12 mg L-DOPA/1000 g Körpergewicht. Die ergänzenden Informationen enthalten ein Beispiel für Berechnungen zur Bestimmung der Menge an L-DOPA und Kochsalzlösung, die für jeden Tag einer Woche benötigt wird, unter Verwendung von 12 mg L-DOPA/kg Körpergewicht bei einem Injektionsvolumen von 1 cm³/kg Rattengewicht.
2. Raum- und Käfigeinrichtung
- Am ersten Tag der L-DOPA-Behandlung 3-4 Wochen nach der Operation an 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)-Läsionen sind die Ratten in Einzelställe zu überführen, einschließlich einer von der IACUC zugelassenen Anreicherung.
- Bleiben Sie während der gesamten Studie in einer Einzelunterkunft, um eine Einmischung von Gleichaltrigen in die Verhaltensbewertungen zu vermeiden.
- Stellen Sie die Heimkäfige an den Tagen der LID-Bewertung auf ein Stahlgitter, das in einem Winkel von etwa 45° gedreht ist, um die Ratte optimal zu sehen (Abbildung 2A). Drehen Sie die Identifikationsetiketten (Abbildung 2B) nach oben, und entfernen Sie Wasserflaschen, Futterregale und alle Arten von Anreicherungen im Käfig (Abbildung 2C), um eine Beeinträchtigung der Verhaltensbewertung zu vermeiden.
>3. Levodopa-Injektionen und Dyskinesie-Bewertung
- Subkutane Injektionen von L-DOPA
- Unmittelbar vor der täglichen Injektion von L-DOPA das entsprechende Volumen steriler Kochsalzlösung zu der vorgewogenen lyophilisierten Mischung aus L-DOPA und Benserazid in der braunen Durchstechflasche geben und 10 s lang gut schütteln (Schritt 1.3).
HINWEIS: Das Zielinjektionsvolumen beträgt 1 ml/1000 g Körpergewicht (mit 12 mg L-DOPA pro ml). Das Volumen der sterilen Kochsalzlösung hängt von der Anzahl der Tiere pro Studie ab.
- Füllen Sie einzelne Spritzen (z. B. 1,0 oder 0,5 mL mit 26 G Nadel) mit dem erforderlichen Volumen für jedes Tier (1 mL/kg Rattengewicht) und beschriften Sie jede Spritze mit einer individuellen Tierkennzeichnung.
Anmerkung: Bewahren Sie die gefüllten Spritzen bis zum Zeitpunkt der Injektion lichtgeschützt in sterilen Beuteln auf. L-DOPA oxidiert schnell in Gegenwart von Sauerstoff und Licht in einer wässrigen Umgebung.
- Bringen Sie den ersten Käfig zur Injektionsbank.
- Nehmen Sie die Ratte aus ihrem Käfig und legen Sie sie auf die Injektionsfläche.
- Halten Sie den Kopf und die Schultern vorsichtig mit der Handfläche der nicht dominanten Hand gegen die Oberfläche, auf der die Ratte ruht.
- Streichen Sie die Haut auf dem Rücken, die über den Schulterblättern liegt, vorsichtig mit Daumen und Zeigefinger der nicht dominanten Hand ab. Injizieren Sie dann das L-DOPA-Volumen mit der dominanten Hand in den subkutanen Raum zwischen/unter den Fingern und halten Sie die Nadel so parallel wie möglich zum Körper, um eine intramuskuläre Injektion zu vermeiden.
Anmerkung: Die Ratten werden vor der Injektion nicht betäubt.
- Entsorgen Sie jede einzelne gebrauchte Spritze in einem scharfen Behälter.
- Setzen Sie die Ratte in ihren Einzelkäfig zurück und fügen Sie ernährungsphysiologisch vollständige Leckerlis hinzu, außer an LID-Bewertungstagen, um eine Beeinträchtigung der Verhaltensbewertungen zu vermeiden, bis die Bewertungen abgeschlossen sind.
- Stellen Sie den Timer auf 1–2 Minuten ein, abhängig von der gewünschten Bewertungszeit und der Anzahl der Ratten in der Studie an den Bewertungstagen. Holen Sie sich den nächsten Käfig und injizieren Sie die nächste Ratte, wenn der Timer anzeigt.
- Wiederholen Sie dies und injizieren Sie alle 1–2 Minuten eine Ratte, bis alle Ratten injiziert sind.
- Bewertung der Levodopa-induzierten Dyskinesie nach der Injektion
- Bewerten Sie die Intensität (Tabelle 1) und Häufigkeit (Tabelle 2) von dystonen und hyperkinetischen Dyskinesiebewegungen zu der gewünschten Anzahl von Zeitpunkten, die den anfänglichen Beginn des LID-Verhaltens, das Spitzenverhalten und die Phase des Rückgangs umfassen sollten.
- Bei männlichen und weiblichen erwachsenen Ratten mit Sprague Dawley oder Fisher 344 und einer Stichprobengröße von N = 40 Ratten beginnen die Dyskinesie-Bewertungen 20 Minuten nach der ersten L-DOPA-Injektion und dann in 50-Minuten-Intervallen bis 220 oder 270 Minuten nach der Injektion, je nachdem, wann das LID-Verhalten bei 90 % bis 100 % der Ratten abgebrochen wurde.
- Wenn Sie Bewertungsintervalle von 1 Minute verwenden, stellen Sie einen Timer auf 1 Minute ein. Bewerten Sie die erste Ratte eine Minute lang. Gehen Sie zur nächsten Ratte und bewerten Sie sie 1 Minute lang. Fahren Sie mit dem Durchlaufen aller Ratten fort, wobei die Bewertung in 1-Minuten-Intervallen durchgeführt wird.
- Platzieren Sie einen Timer sichtbar neben dem Käfig, damit die Intensität des LID-Verhaltens (Tabelle 1) beobachtet werden kann, während die Häufigkeit eines bestimmten Verhaltens (Tabelle 2) während des Bewertungszeitraums geschätzt wird.
- Nachdem die Bewertungen für den ersten Zeitpunkt abgeschlossen sind, beginnen Sie zum nächsten Zeitpunkt (z. B. 70 Minuten nach der Injektion) erneut mit der ersten Ratte und fahren Sie im gewünschten Intervall (z. B. alle 50 Minuten) fort, bis alle Zeitpunkte abgeschlossen sind.
Anmerkung: Aufgrund der Überschneidung von L-DOPA-Injektion und LID-Rating-Aufgaben werden an den Rating-Tagen zwei Personen benötigt, eine für die Injektion und eine für die Verhaltensbewertung.
