Detektion der neuronalen Alterung in einem kortikalen Organoidschnitt

Zusammenfassung

Quelle: Shaker, M. R., et al. Robuste und hochgradig reproduzierbare Generierung von kortikalen Hirnorganoiden zur Modellierung der neuronalen Seneszenz des Gehirns in vitro. J. Vis. exp. (2022).

Dieses Video zeigt die Methode zum Nachweis alternder Neuronen in kortikalen Organoidschnitten durch Färbung der Beta-Galactosidase-Aktivität, die in seneszenten Zellen erhöht ist. Das Enzym spaltet ein Substrat, um ein blaues Produkt zu erzeugen, gefolgt von einer mikroskopischen Beobachtung der gefärbten Neuronen.

Protokoll

Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Charakterisierung der neuronalen Alterung in kortikalen Organoiden

1. Verarbeiten Sie kortikale Organoide für Kryoschnitte:
   HINWEIS: Die Schritte wurden in einer Biosicherheitshaube der Klasse 2 durchgeführt.
   1. Bereiten Sie 2 ml-Röhrchen vor, die jeweils mit 1,5 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) gefüllt sind.
   2. Schneiden Sie das Ende einer P1000-Pipettenspitze ab (um es zu einer breiten Öffnung zu machen) und übertragen Sie jedes Organoid vorsichtig in eines der oben vorbereiteten 2-ml-Röhrchen (ein Organoid pro Röhrchen).
      HINWEIS: Um zu verhindern, dass sich überschüssiges Differenzierungsmedium (DM)-Medium mit dem PFA vermischt, lassen Sie das Organoid zur Öffnung der P1000-Pipettenspitze absinken und legen Sie die Spitze knapp über der Oberseite des PFA in das Röhrchen, bevor Sie das Organoid herauspipettieren. Dies wird es dem Forscher ermöglichen, nur das Organoid und sehr minimale Medien zu übertragen.
   3. Lassen Sie den Fixierungsprozess 1 h lang bei 4°C stattfinden.
   4. Mit einer ungeschnittenen P1000-Pipettenspitze vorsichtig überschüssiges PFA absaugen und 1,5 ml kalte 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) hinzufügen.
   5. Übertragen Sie die Röhrchen für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) in einen Orbitalschüttler, der auf 70 U/min eingestellt ist.
   6. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit kaltem 1x PBS dreimal, um sicherzustellen, dass alle PFA vollständig entfernt wurden.
      HINWEIS: Entsorgen Sie PFA nicht in normalen Abfallbehältern; Bereiten Sie stattdessen einen speziellen Entsorgungsbehälter für chemische Abfälle vor, da PFA eine Gefahr darstellt.
   7. Tauchen Sie die Organoide in 1x PBS mit 30% Saccharose und inkubieren Sie bei 4 °C, bis alle Organoide auf den Boden des Röhrchens gesunken sind.
      HINWEIS: Die Zeit, die die Organoide benötigen, um abzusinken, hängt von ihrer Größe und ihrem Alter ab. Drei Monate alte Organoide können bis zu 5 Stunden brauchen.
   8. Mit einer geschnittenen P1000-Pipettenspitze mit breiter Bohrung werden drei bis fünf Organoide vorsichtig in eine Einbettform überführt, die eine Einbettlösung aus 30 % Saccharose und 100 % Medium für optimale Schnitttemperatur (OCT) im Verhältnis 3:2 enthält.
   9. Verwenden Sie eine 10-μl-Pipettenspitze mit Hilfe eines Stereomikroskops, um Organoide in einem gitterartigen Muster zu orientieren und zu positionieren.
   10. Legen Sie die Form auf Trockeneis, um die Saccharose-OCT-Lösung zu verfestigen, bevor Sie mit dem Kryoschnitt (16-20 μm) mit einem Kryostaten fortfahren.
       HINWEIS: Bei Seneszenz-assoziierter Beta-Galactosidase müssen alle Gewebe für die Sektion aufbereitet werden, sobald sie abgesunken sind. Für die Immunfluoreszenz können Gewebe für die Schnitte am nächsten Tag aufbereitet werden. Wenn sie nicht sofort gefärbt werden, müssen alle Objektträger, die Schnitte enthalten, vor der anschließenden Immunfluoreszenz oder Beta-Galactosidase bei -20 °C gelagert werden.
2. Verfahren zur Analyse der Seneszenz in den kortikalen Hirnorganoiden:
   HINWEIS: Die folgenden Schritte können auf einem normalen Labortisch durchgeführt werden.
   1. Übertragen Sie die Objektträger in einen Behälter für die Färbung von Objektträgern mit Deckel und waschen Sie das geschnittene Organoidgewebe dreimal mit 1x PBS für 10 min bei RT, um überschüssige Einbettlösung zu entfernen.
   2. Anschließend wird das gewaschene Gewebe über Nacht bei 37 °C mit frisch hergestellter Beta-Galactosidase-Färbelösung inkubiert.
      HINWEIS: Die Beta-Galactosidase-Färbelösung besteht aus Phosphatpuffer (für 10 mL Phosphatpuffer: 8,15 mL 1 M NaH₂PO₄, 1,85 mL 1M Na₂HPO₄) eingestelltem pH-Wert = 6,100 mM Kaliumhexacyanoferrat (III), 100 mM Kaliumhexacyanoferrat-(II)-trihydrat, 5 M NaCl, 1 M MgCl₂, 20 mg/ml X-Gal. Vermeiden Sie die Verwendung eines Standard-Zellkultur-Inkubators, der CO₂ enthält, da das CO₂ den pH-Wert der Beta-Galactosidase-Färbelösung verändert.
   3. Um die Beta-Galactosidase-Lösung zu entfernen, waschen Sie die verfärbten Tücher dreimal für je 10 min mit 1x PBS bei RT.
   4. Montieren Sie das gewaschene Gewebe mit einem Glas-Antifading-Eindeckmittel und lassen Sie die Eindecklösung 30 Minuten lang bei RT erstarren, bevor Sie sie unter dem Mikroskop betrachten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
16% Formaldehyd (W/V) Methanolfrei	Thermo Fisher Wissenschaftlich	28908	4% des PFA werden in 1x PBS verdünnt
CKX53 Mikroskop mit SC50 Kamera	Olymp
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma Aldrich Pty Ltd	D1408-500ML
Neurobasales Medium	Thermo Fisher Wissenschaftlich	21103049	Wird in DM-Medien verwendet
OCT Einbettmasse Sakura Clear (118 mL/Flasche)	Gewebe-Tek	4583
Kaliumhexacyanoferrat (II)-trihydrat	Sigma Aldrich Pty Ltd	CP1087
Kaliumhexacyanoferrat(III)	Sigma Aldrich Pty Ltd	455946
Prolong Glas-Eindeckmittel	Life Technologies Australien (TFS)	P36980
Saccharose	Sigma Aldrich Pty Ltd	PHR1001-1G	30% der Saccharose werden in 1x PBS verdünnt