Handhabungsinduzierte Anfälle in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Batot, G., et al. Ein Modell für Epilepsie der infektiösen Ätiologie unter Verwendung des Theiler-Maus-Enzephalomyelitis-Virus. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video zeigt die Induktion von Handling-induzierten Anfällen bei einer Maus, die mit dem Theilerschen Murinen Enzephalomyelitis-Virus (TMEV) infiziert war. Die infizierte Maus, die über übererregbare Neuronen verfügt, wird äußeren physikalischen Reizen ausgesetzt. Diese Exposition verursacht Stress, was zu einer abnormalen elektrischen Aktivität in den Neuronen führt, was zu Krampfanfällen führt.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Virusimpfung

1. Sterilisation der Injektionsspritze
   1. Entfernen Sie die Kappe der Insulinspritze. Fügen Sie einen Polyethylenschlauch als Kragen um die Nadel hinzu, um eine ausreichende Injektionstiefe von 2,5 mm zu gewährleisten. Tauchen Sie die Spritze 30 Minuten lang in Ethanol. Halten Sie die Spritze 30 Minuten lang unter UV-Licht.
   2. Setzen Sie die Kappe wieder auf die Nadel. Wickeln Sie die Spritze in einen Sterilisationsbeutel und kleben Sie ihn mit Klebeband zu. Etikett mit dem Datum der Zubereitung.
2. Injektion von Viren
   1. Holen Sie sich Aliquots von Daniels TMEV-Stamm aus dem -80 °C Gefrierschrank. Tauen Sie das Virus auf und halten Sie es auf Eis. Vermeiden Sie das Auftauen und erneute Einfrieren des Virus. Laden Sie die Spritze mit der Virussuspension (3 x 10⁵ Plaque-bildende Einheit [PFU], verdünnt in 20 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS] oder Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium [DMEM]-Kulturmedium).
      VORSICHT: Das Virus ist für Mäuse infektiös, aber nicht für Menschen.
   2. Reinigen Sie die Bank mit einem Desinfektionsmittel und arbeiten Sie unter einem Rauchabzugsgerät. Die Virusimpfung ist nicht steril, sondern so sauber wie möglich.
   3. Übertragen Sie die Maus in die Anästhesie-Induktionskammer und verwenden Sie 2% Isofluran in Sauerstoff, um die Anästhesie einzuleiten. Das Erreichen der chirurgischen Toleranz dauert einige Minuten; Passen Sie die Konzentration basierend auf der Atmung des Tieres und der Anästhesietiefe an.
   4. Übertragen Sie die betäubte Maus aus der Anästhesiebox unter der Haube. Überprüfen Sie die chirurgische Verträglichkeit, z. B. durch Zehenklemme. Das gesamte Verfahren wird in weniger als 30 s durchgeführt, so dass das Tier während der Injektion kein Isofluran inhalieren muss. Fügen Sie Augensalbe hinzu, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
   5. Reinigen Sie den Kopf des Tieres mit einem Alkoholtupfer. Neigen Sie den Kopf der Maus leicht nach links, so dass die Injektionsstelle nach oben zeigt.
   6. Ziehen Sie die Haut etwas nach hinten, stechen Sie die Nadel in den Kopf ein und injizieren Sie 20 μl intrakortikal bis zu einer Tiefe von 2,5 mm in den Schläfenbereich der rechten Hemisphäre (posterior und medial zum rechten Auge).
   7. Führen Sie die Injektion bei allen Tieren einseitig in derselben Hemisphäre durch. Verwenden Sie das Auge und das Ohr als Orientierungspunkte für die Position des parietalen Kortex. Die Einordnung wurde zuvor histologisch verifiziert; siehe Abbildung 1. Die Injektionskoordinaten gemäß der stereotaktischen Injektion in Bezug auf Bregma betragen -2,0 (AP); +3,0 (ML); -1,5 (DV).
   8. Lassen Sie die Spritze 5-15 s lang an Ort und Stelle. Notieren Sie, ob durch die Injektion ein Leck aufgetreten ist oder ob Luftblasen zu sehen sind - in diesem Fall bereiten Sie eine neue Spritze vor. Wenn Sie die Spritze vorsichtig herausziehen, drehen Sie sie leicht. Tragen Sie Augensalbe auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
   9. OPTIONAL: Kodieren Sie das Tier am Schwanz oder am Ohr, abhängig von lokalen Verfahren (optional, aber einfach, da das Tier bewusstlos ist).
   10. Bringen Sie das Tier in einen neuen Käfig, der während der Genesung von der Narkose halb auf/halb von einem Heizkissen (35-40 °C) platziert wird. Lassen Sie die Tiere nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
       HINWEIS: Tiere können nach der Genesung wieder in Gruppen untergebracht werden (infizierte Tiere werden nicht mit scheininfizierten Tieren vermischt). Infizierte Mäuse sollten nicht im selben Raum wie nicht infizierte Mäuse untergebracht werden.
   11. Behalten Sie das Gewicht der Mäuse in den ersten 7 Tagen nach der Infektion im Auge, da sie nach der Infektion an Gewicht verlieren und möglicherweise zusätzliche Fütterung benötigen.

2. Überwachung von Anfällen, die durch die Handhabung induziert werden

1. Führen Sie dieses Verfahren durch einen Experimentator durch, der für die Behandlung verblindet ist. Bringen Sie alle Käfige zur Bank. Beobachten Sie die Tiere während der Lichtphase 2x täglich auf Anfälle.
2. Bewerten Sie die Anfallsaktivität mit einer modifizierten Racine-Skala: 0 = keine Veränderung des Verhaltens, 1 = Mund- und Gesichtsbewegungen, 2 = Kopfnicken, 3 = einseitiger Klonus der Vordergliedmaßen, 4 = beidseitiger Klonus der Vordergliedmaßen mit Aufzucht, 5 = generalisierte tonisch-klonische Aktivität mit Verlust des Haltungstonus, manchmal Springen, 6 = verlängertes und übermäßiges Springen und Hyperaktivität. Geben Sie die Anzahl und Intensität der Anfälle an.
3. Schiebe einen Stift über den Käfig, um etwas Lärm zu machen.
4. Setze jedes Tier in eine andere Box um und zurück.
5. Schütteln Sie den Käfig vorsichtig hin und her und achten Sie darauf, den Käfig nicht so stark zu schütteln, dass die Tiere gegen die Seiten oder die Oberseite des Käfigs stoßen und Gefahr laufen, sich körperlich zu verletzen.
6. Überwachen Sie alle Tiere im Käfig auf Anfälle. Wenn eine Maus einen Anfall hat, bringen Sie sie jederzeit zurück in den Heimkäfig und notieren Sie den Grad des Anfalls, ohne dass der Anfall durch Lärm oder Handhabung weiter stimuliert wird.
7. Bei Tieren, die nicht spontan oder nach leichtem Käfigschütteln gefressen haben, lösen Sie Anfälle durch intensivere Handhabung aus: Drehen Sie die Maus vorsichtig um, indem Sie sie am Schwanz von links nach rechts drehen.
   HINWEIS: Tiere mit Anfällen sind übererregbar und können schreckhaft sein.
8. Beobachten Sie jedes Tier erneut auf sein Anfallsverhalten. Wiederholen Sie den Vorgang für nachfolgende Käfige.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des TMEV-Injektionsverfahrens. Von links nach rechts: Bei einer Injektion der rechten parietalen Rinde wird die Nadel etwas lateral einer imaginären Linie zwischen dem Auge und dem gegenüberliegenden Ohr injiziert. Der Kragen für die Tiefenkontrolle ist gelb markiert. Der Injektionstrakt ist im koronalen Hirnschnitt zu sehen, markiert durch den Pfeil. Die Injekti...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gleichgewicht der Tiere	Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.)	STX2202	0,01 g–2200 g
BD U-100 Insulinspritzen mit niedriger Dosis	BD (Mississauga, ON, Kanada)	BD329461	Sterile Lo-Dose-Spritzen mit permanenter BD Micro-Fine IV-Nadel - 1 mL
Daniels Stamm von TMEV	Mit freundlicher Verfügung von Robert Fujinami (University of Utah)	-	3 x 105 plaquebildende Einheiten aliquot(en)
Desinfektionsmittel, z.B. VennoVet 1 super	Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Deutschland	-	Empfohlen von Campus-Tierärzten mit weniger als oder gleich 5% Alkohol
Fisherbrand mittelsteriles Alkohol-Vorbereitungspad C7	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)	22-363-750
Fluriso	VETone (Boise, ID, U.S.A)	502017	Isofluran 250 ml, 2%–5%
Rauchabsorber	Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.)	-	-
Allgemeiner Schutz Einweg-SMS-Laborkittel in Weiß	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)	17-100-810A
Eiskübel	-	-	beliebig
Maus-Käfig	-	-	jeder Mäusekäfig mit mindestens 5 Mäusen
PrecisionGlide-Nadeln	BD (Mississauga, ON, Kanada)	329652	BD Slip Tip mit PrecisionGlide Nadel Insulinspritzen - 26 g x 3/8 - 0,45 mm x 10 mm
Selbstverschließender Sterilisationsbeutel	Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.)	NC9241087	12,6 x 25,5 cm
Kleiner Glaskolben	-	-	beliebig, Volumen 25 mL
sterile PBS	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.)	10010056
Spritze Luer-Lok	BD (Mississauga, ON, Kanada)	309628	Nur 1-ml-Spritze
Ultraschallreiniger, Heizung/mechanischer Timer	Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.)	EW-08895-23	Bad-Ultraschallgerät - 0,5 gal, 115 V