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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Zubereitung der Lysophosphatidylcholin (LPC)-Lösung
- 25 mg LPC-Pulver (siehe Table of Materials) mit 250 μl Chloroform- und Methanol-Mischlösung (1:1) auflösen, um eine 10%ige LPC-Lösung herzustellen, und in ein 500 μl-Zentrifugenröhrchen überführen.
HINWEIS: Wenn das LPC nicht vollständig aufgelöst ist, legen Sie das Zentrifugenröhrchen in einen Ultraschallreiniger und beschallen Sie es bei 40 kHz für ~1 h, um eine gleichmäßige Lösung zu erhalten.
- Die Lösung wird in 3 μl/Röhrchen aufgeteilt und bei −80 °C gelagert.
HINWEIS: Die Lösung kann ~2 Jahre gelagert werden.
- Vor der Operation verdünnen Sie die Lösung (Schritt 1.2) mit 27 μl 0,9%iger Natriumchlorid (NaCl)-Lösung und halten Sie die Lösung in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur bei 37 °C.
HINWEIS: Bereiten Sie die Lösung vor, bevor Sie mit der Injektion beginnen.
2. Chirurgische Vorbereitung
- Verwenden Sie eine 32-G-Nadel mit einem Durchmesser von 2 Zoll, um eine 5-μl-Spritze anzuschließen (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass die Mikroliterspritze frei ist. Entnehmen Sie 5 μl LPC-Lösung, um die Injektion vorzubereiten.
- Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer, die mit einem Isofluran-Verdampfer verbunden ist, mit 3 % Isofluran, gemischt mit 100 % Sauerstoff, mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,3 l/min.
- Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen eines Zehenkneifreflexes bei gleichmäßiger Atmung.
- Rasieren Sie den Kopf der Maus zwischen den Ohren mit einem Elektrorasierer. Tragen Sie befeuchtende Augentropfen auf, um eine Trockenheit der Hornhaut während des Eingriffs zu verhindern.
- Positionieren Sie dann die Maus mit der Rückenseite nach oben in einem stereotaktischen Rahmen (siehe Table of Materials) und befestigen Sie den Kopf mit einem Nasenkonus und einer Zahnklemme. Halten Sie die Anästhesie mit 1,2 % bis 1,6 % Isofluran durch die Nase aufrecht.
HINWEIS: Die Isoflurankonzentration kann entsprechend dem Atmungsstatus der Mäuse angepasst werden.
3. Chirurgischer Eingriff
HINWEIS: Die Tiere werden während aller Eingriffe auf ein Heizkissen gelegt.
- Befestigen Sie die Maus mit beidseitigen Ohrbügeln an der stereotaktischen Vorrichtung. Stellen Sie sicher, dass die Ohrbügel waagerecht und der Kopf waagerecht und stabil ist.
- Desinfizieren Sie die Haut am Kopf, indem Sie sie mehrmals mit Jodophor abwischen, gefolgt von Alkohol in kreisenden Bewegungen. Dann wird mit einem Skalpell ein kleiner Schnitt von etwa 1,5 cm entlang der Mittellinie der Kopfhaut geschnitten, um den Schädel freizulegen.
- Wischen Sie den Schädel mit einem in 1%iges Wasserstoffperoxid getauchten Wattestäbchen ab, bis das Bregma, das Lambda und die hintere Fontanelle freiliegen. Setzen Sie die Spritze auf das stereotaktische Gerät.
HINWEIS: Verwenden Sie Wasserstoffperoxid mit Vorsicht und vermeiden Sie es, das umgebende Gewebe zu berühren.
- Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres horizontal positioniert ist (sowohl vorne als auch hinten und links und rechts).
- Stellen Sie den Z-Achsen-Knopf des stereotaktischen Rahmens so ein, dass sich die Nadelspitze und der Schädel gerade berühren, ohne sich zu biegen, und messen Sie dann die Koordinate der Z-Achse. Überprüfen Sie die Z-Koordinaten der Bregma und der hinteren Fontanelle.
- Stellen Sie den Ohrbügel so ein, dass die Differenz zwischen den Z-Koordinaten von Bregma und hinterer Fontanelle nicht mehr als 0,02 mm beträgt. Befolgen Sie dann die gleiche Methode, um die Z-Koordinaten der entsprechenden Positionen auf der linken und rechten Seite der Mittellinie zu messen. Stellen Sie den Ohrbügel so ein, dass sich links und rechts auf gleicher Höhe befinden.
- Lokalisieren Sie das Corpus callosum. Legen Sie den XYZ-Ursprung auf Bregma fest.
HINWEIS: Die erste Injektionsstelle ist 1,0 mm lateral des Bregmas, 2,4 mm tief und 1,1 mm anterior. Die zweite Injektionsstelle ist 1,0 mm lateral des Bregmas, 2,1 mm tief und 0,6 mm anterior. Zum Beispiel ist die Koordinate des Bregma (0,0,0). Messen Sie die Z-Koordinate der entsprechenden Position, die als (-1, 1,1, X) und (-1, 0,6, Y) markiert ist. Es kann bestimmt werden, dass die Koordinate der ersten Injektionsstelle des Corpus callosum (-1, 1,1, −[X + 2,4]) und die zweite Injektionsstelle (-1, 0,6, −[Y + 2,1]) ist.
- Sobald die Injektionsstelle bestimmt ist, markieren Sie den Schädel mit einem sterilen Marker und notieren Sie die Koordinaten.
- Bohren Sie die markierte Stelle vorsichtig mit einem Schädelbohrer (siehe Table of Materials). Achten Sie darauf, Blutungen zu vermeiden.
- Bewegen Sie die Nadel langsam auf die angegebenen Koordinaten und starten Sie die Injektion. Um eine Demyelinisierung des Corpus callosum zu induzieren, injizieren Sie 2 μl LPC-Lösung (Schritt 1.2) an jeder Injektionsstelle (Schritt 3.5.) mit einer Geschwindigkeit von 0,4 μl/min.
- Nach der Injektion halten Sie die Nadel für weitere 10 Minuten an jeder Stelle.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Abstand von zwei Injektionen nicht mehr als 20 Minuten beträgt.
- Vernähen Sie die Haut mit einer 4-0-Naht und warten Sie, bis das Tier innerhalb von 10 Minuten aufwacht. Verabreichen Sie postoperativ Analgetika in Übereinstimmung mit den Vorschriften der institutionellen Tierpflege.
HINWEIS: Die empfohlene Zeit für die Euthanasie kann je nach Zweck des Experiments bestimmt werden.