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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Zubereitung von Hämoglobin- und Liquorlösungen
- Bereiten Sie eine sterile künstliche Liquorlösung (aCSF) vor, indem Sie 500 μl der aCSF-Lösung in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen geben und auf Eis lagern.
- Bereiten Sie eine sterile Hämoglobinlösung von 150 mg/ml vor, indem Sie 75 mg Hämoglobin zu 500 μl aCSF in einem 1,5 ml-Mikroröhrchen hinzufügen und auf Eis lagern.
2. Vorbereitung des Tieres für die Injektion
- Drehen Sie das Heizkissen auf die mittlere Stufe, um die Körpertemperatur der Ratte zu halten.
- Anästhesieren Sie postnatale Tag-4-Ratten (P4) in einer Induktionskammer, die mit 3 % Isofluran gefüllt ist.
HINWEIS: Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie mit der Zehen-/Schwanzkneifreaktion alle 15 Minuten. Überwachen Sie die Anästhesie mit visueller Beobachtung der Gewebefarbe, der Körpertemperatur und der Atemfrequenz.
- Verabreichen Sie der anästhesierten Ratte ein Schmerzmittel mit einer subkutanen Carprofen-Injektion von 5 mg/kg.
- Platzieren Sie die anästhesierte Ratte in Bauchlage in das stereotaktische Gerät, wobei die Nase mit einem konstanten Fluss von 1,5 % Isofluran im Anästhesieadapter positioniert ist.
- Ziehen Sie die reißfesten Ohrbügel am äußeren Gehörgang fest, um den Kopf zu sichern.
HINWEIS: Tragen Sie Tiersalbe auf, um die Augen mit Feuchtigkeit zu versorgen, wenn die Augen im Alter der Injektion geöffnet sind.
- Reinigen Sie den Kopf abwechselnd mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze, die in Betadin und 70 % Ethanol getränkt sind.
- Berühren Sie den mit Betadin getränkten Applikator in der Mitte der Kopfhaut und verteilen Sie das Betadin in Kreisen, indem Sie es nach außen bewegen.
- Schritt 2.6.1.1 mit dem in Ethanol getränkten Applikator wiederholen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.6.1.1 und Schritt 2.6.1.2 3x.
- Tragen Sie ein steriles OP-Tuch auf, um das Operationsfeld zu schützen.
- Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 0,3 cm langen Schnitt senkrecht in der Mitte des Kopfes, um das Bregma des Schädels freizulegen.
HINWEIS: Wenn Sie aus dem Lambda injizieren, legen Sie das Lambda des Schädels anstelle des Bregmas frei.
- Verwenden Sie einen sterilen Applikator mit Wattespitze, um den Bereich zu trocknen.
3. Einrichten des stereotaktischen Injektors
- Die in Schritt 1.2 hergestellte Hämoglobinlösung wird mit einer 30G-Nadel in eine sterile 0,3-ml-Spritze aufgezogen und die Spritze in das stereotaktische Injektorsystem eingeführt.
HINWEIS: Wenn Kontrollbedingungen erzeugt werden, ziehen Sie die in Schritt 1.1 hergestellte Liquorlösung in eine sterile 0,3-ml-Spritze und fahren Sie mit dem Protokoll fort.
- Schalten Sie die stereotaktische Injektorschnittstelle ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Configuration , um die Einstellungen für die Einspritzlautstärke und -rate einzugeben.
- Klicken Sie auf Volumen und stellen Sie das Volumen auf 20.000 nL (20 μL) ein.
- Klicken Sie auf Infusionsrate und stellen Sie die Rate auf 8.000 nL/min (8 μL/min) ein.
- Beenden Sie die Konfiguration , indem Sie auf die Schaltfläche Pos zurücksetzen klicken.
- Spülen Sie die Nadelspitze, indem Sie auf die Schaltfläche Aufgießen klicken, bis eine kleine Kugel Hämoglobinlösung an der Nadelspitze austritt.
- Leiten Sie die Hämoglobinlösung vorsichtig mit einem sterilen Applikator mit Wattespitze von der Nadelspitze ab.
4. Injektion von Tieren
- Setzen Sie das Bregma Bregma auf Null auf dem stereotaktischen Injektorsystem, indem Sie die mediolaterale und anteroposteriore Position der Spritze anpassen, bevor Sie die Spitze der gespülten Spritzennadel absenken, um den Schädel sanft am Bregma zu berühren.
HINWEIS: Wenn Sie aus dem Lambda injizieren, setzen Sie lambda als null.
- Identifizieren Sie die gewünschten Koordinaten.
- Bei der Injektion aus dem Bregma bei P4-Ratten , die hier beschrieben werden, verwenden Sie 1,5 mm lateral, 0,4 mm anterior und 2,0 mm tief aus dem Bregma.
- Wenn du aus dem Lambda injizierst, verwende die folgenden Koordinaten für P4-Ratten: 1,1 mm lateral, 4,6 mm anterior und 3,3 mm tief vom Lambda.
- Heben Sie die Spritzennadel 1 cm über den Schädel, um die Kopfhaut zu reinigen. Wenn die Spritze angehoben wird, stellen Sie die mediolateralen und anteroposterioren Koordinaten ein.
- Senke die Spritzennadel, um den Schädel sanft zu berühren. Vergewissern Sie sich, dass die Nadel den Schädel berührt.
- Stellen Sie die dorsoventrale Koordinate über einen Zeitraum von 30 s ein.
HINWEIS: Beim Einstellen der dorsoventralen Koordinate durchsticht die Nadel den Schädel. Es muss darauf geachtet werden, dass die Spritze den Schädel passiert, ohne den Schädel zu verformen. Eine Schädelverformung wird vermieden, indem die Nadel langsam entlang der dorsoventralen Koordinate zurückgezogen wird, wenn eine Verformung auftritt, und die Nadel dann entlang der gleichen Flugbahn wieder zurückführt. Dadurch kann die Nadel mit weniger Kraft und ohne Verformung durch das Loch im Schädel geführt werden.
- Klicken Sie auf der stereotaktischen Injektorschnittstelle auf die Schaltfläche Ausführen , um die Injektion zu starten.
- Lassen Sie die Spritzennadel nach Beendigung der Injektion 2 Minuten lang an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Lösung zu minimieren.
- Ziehen Sie die Spritze langsam entlang der dorsoventralen Koordinate über 2 Minuten zurück, bis sich die Nadelspitze 2 cm über der Kopfhaut befindet.
- Drehen Sie den stereotaktischen Injektorarm vom Operationsfeld weg.
5. Postoperative Versorgung
- Verschließen Sie die Kopfhaut mit einer monofilen Naht 6-0. Machen Sie eine einfache unterbrochene Naht in der Mitte des 0,3 cm langen Schnitts.
- Nehmen Sie den Welpen aus der Narkose und legen Sie ihn auf eine sichere Stelle auf dem Heizkissen.
- Bringen Sie das Nagetier in den Heimkäfig zurück, damit es sich unter der Obhut seines Muttertiers von der Narkose erholen kann.
HINWEIS: Die rechtzeitige Rückkehr in die Obhut des Muttertiers reduziert die frühe postoperative Mortalität.
- Überwachen Sie die Tiere für die Anästhesie durch Verlust des Aufrichtungsreflexes stündlich nach der Operation für 3 Stunden.
- Überwachen Sie die Tiere 7 Tage lang täglich auf normale Aktivität, Nahrungsaufnahme und Gewichtszunahme. Überwachen Sie die Inzisionsstelle auf Wundheilung, Verschluss und Wiederauftreten des Fells an der Operationsstelle.
HINWEIS: In dem seltenen Fall, dass neurologische Veränderungen wie Krampfanfälle, zentrale Depression oder verminderter Appetit während der Überwachung beobachtet werden, euthanasieren Sie das Tier mit intravaskulärer Perfusion oder zervikaler Luxation unter Narkose.
- Um eine Infektion zu verhindern, sobald die Naht geschlossen ist und die Wunde heilt, tragen Sie ein topisches Dreifach-Antibiotikum an der Inzisionsstelle auf.